| 研究分担者 |
江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
今井 一洋 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (50012620)
香川 靖雄 女子栄養大学, 医化学研究室, 教授 (30048962)
丸山 正 海洋バイオ研究所, 釡石研究所, 主任研究員
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| 配分額 *注記 |
13,600千円 (直接経費: 13,600千円)
1999年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
1998年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
1997年度: 7,200千円 (直接経費: 7,200千円)
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| 研究概要 |
超好熱性古細菌であるThermococcus属およびPyrococcus属にはほぼ普遍的にD-アミノ酸が存在することを明らかにした.特にアスパラギン酸のほとんどラセミ化していた.Thermococcus starin KS-8由来アスパラギン酸ラセマーゼの全長遺伝子を単離し,大腸菌で生産した.この組換え体は70℃でアスパラギン酸ラセマーゼ活性を有しており,微弱ではあるがグルタミン酸など他のアミノ酸に対するラセマーゼ活性もあった.Pyrococcus horikoshii由来の2種類のアスパラギン酸ラセマーゼホモローグ(PH0670,PH1733)及びArchaeoglobus fulgidus由来アスパラギン酸ラヤマーゼホモローグ(AF1422)を大腸菌発現系から精製した.いずれも,熱に安定であり,70℃で30分程度熱処理をすることにより大腸菌由来の他のタンパク質をほとんど除去することができた.精製酵素を用いてアスパラギン酸ラセマーゼ活性を測定したが,PH0670のみアスパラギン酸ラセマーゼ活性があった.80℃で,D-Aspを基質として活性を調べたところ,Michaelis-Menten型反応であった.Km値は3.6E^<-3>(M),Vmaxは4.2E^<-11>(mol/sec)であった.一方,PH1733とAF1422にはアミノ酸ラセマーゼ活性はなかった.大腸菌のOrfXと呼ばれている機能不明遺伝子との相同性などからDiaminopimelate Epimerase活性を示すと予想して活性を測定したが,活性は確認されなかった.PH0670,PH1733,AF1422及びコントロールとして用いたArchaeoglobusのDiaminopimelate Epimeraseの結晶化を試み,4種類全てのタンパク質の結晶を得ることに成功した.また,超好熱性以外の古細菌におけるD-アミノ酸の存在を調べたところ,Thermoplasma acidophilumのアスパラギン酸が高度にラセミ化しておりD-Aspが大量に蓄積していたが,その生成機構は不明である
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