| 研究概要 |
魚肉タンパク質中、ミオシンは最も多い成分で、その性状は魚肉の加工適性や貯蔵適性に大きな影響を与えるが、一次構造の情報がほとんどないため、分子レベルの研究は困難をきわめている。そこで本研究は、コイ普通筋を対象に、遺伝子工学的手法を用いてミオシン重鎮および軽鎖サブユニットの全一次構造を解明することを目的とした。
コイの普通筋ミオシンはサブユニット構造をとり、1分子は約200kDaの重鎮2本と、20kDa前後の軽鎖4本からなる。さらに、ミオシン1分子には、アルカリ条件下で重鎖から解離するアルカリ軽鎖2本と、5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)処理で重鎖から解離するDTNB軽鎖2本が含まれる。アルカリおよびDTNB軽鎖はそれぞれ、必須および調節軽鎖とも呼ばれている。
そこでまず、コイ普通筋からL‐メロミオシン(LMM)を単離し、N末端アミノ酸配列を解析した。次に、この配列をもとにDNAプライマーを合成し、PCRでLMMの一部領域をコードするDNAを増幅した。さらに、cDNAライブラリーを構築し、先の増幅DNA断片をプローブにスクリーニングを行った。その結果、10℃および30℃馴化コイで主に発現するタイプと、両タイプの中間的な塩基配列を示す中間型の3つのミオシン重鎖アイソフォーム全長をコードするcDNAを単離し、全一次構造を決定した。いずれのタイプも1,849〜1,845アミノ酸をコードしていた。
次に、前述のライブラリーから、申請者らが以前調製したカツオ普通筋に対するウサギのポリクローナル抗体を用いて、アルカリ軽鎖およびDTNB軽鎖の全長をコードするクローンを単離し、全一次構造を決定した。その結果、A1およびA2軽鎖はそれぞれ193および151アミノ酸からなることが示された。なお、両軽鎖のアミノ酸変異は分子全体にわたり、異なる遺伝子でコードされていることが示唆された。一方、DTNB軽鎖は、166アミノ酸からなることが明らかにされた。
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