| 研究課題/領域番号 |
09470405
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能系基礎歯科学
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
安孫子 宜光 (安孫子 宣光) 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (70050086)
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| 研究分担者 |
木山 道子 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (50256905)
平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 助手 (80246917)
城座 映明 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (50271333)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
5,900千円 (直接経費: 5,900千円)
1999年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1998年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1997年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | Porphyromonas gingivalis / サブトラクション / 欠損株 / cDNA / subtraction / 差分化 / クローニング / 原核細胞 / 遺伝子ライブラリー |
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| 研究概要 |
本研究は、原核細胞のcDNAライブラリーの構築、新規遺伝子のカタログ化などの先端技術を実用化させ、新たな病原遺伝子の検索とコードタンパク質の機能解析を目的とした。実験はヘミンで誘導される遺伝子の探索、培養時期における遺伝子の変動および酸素下における遺伝子の変動とした。各条件下で培養し、集菌後、全RNAを分離した。rRNAを除去する目的で16Sおよび23SrRNA遺伝子上にビオチンラベルのPCRプローブを設定し、染色体DNAでのPCR産物を用いて、サブトラクトし、ストレプトアビジン磁気ビーズにてこれを除去した。サンプルの一方をビオチンラベルしたcDNAを合成し、精製に限界ろ過フィルターを用いることで、サイズの小さな5SrRNAやtRNAを除去した。得られたcDNA同士をサブトラクトすることで、ある条件下で特異的に発現してる遺伝子のみを残した。クローニングベクターに挿入し、大腸菌にトランスフォーメーションすることでSub-tracted cDNAライブラリーを作製した。挿入されてる断片をDNA sequencingし、そのhomology検索を行った。homologyの存在する遺伝子に関しては、さらにRT-PCRやNorthern-blottingによりこれを検証した。培養時期において変動した遺伝子の1つである40k-Da外膜タンパク質遺伝子は、当研究室でクローニングに成功している。本遺伝子をプローブにしてスクリーニングして得られた陽性クローンの遺伝子解析を行ったところ、本遺伝子であることが確認された。この遺伝子の欠損株を作製し、解析を試みたところ、欠損株は他の菌体との共凝集能、自己凝集能、上皮細胞への付着能、赤血球凝集能、各種プロテアーゼ分泌能など様々な病理性が低下してることが判明した。このように原核細胞におけるサブトラクションによるカタログ化は有用な手段になると思われた。
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