| 研究課題/領域番号 |
09470520
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
松田 一郎 熊本大学, 医学部, 名誉教授 (10000986)
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| 研究分担者 |
島田 隆 日本医科大学, 教授 (20125074)
遠藤 文夫 熊本大学, 医学部, 講師 (00176801)
山本 哲郎 熊本大学, 医学部, 教授 (60112405)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
4,600千円 (直接経費: 4,600千円)
1998年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1997年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | 遺伝子治療 / AAVベクター / ベクタープラスミド / rAAVベクター / OTC欠損症 / パッケージングプラスミド / パッケージングセルライン / ベクター |
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| 研究概要 |
ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)遺伝子を持つアデノ随伴ウイルス(AAV)のベクタープラスミドをITR-ITR間が5.35kbでTX-neo遺伝子を持つもの(以下OTC2)と4.4kbでTK-neoを持たないもの(以下OTC3)を作製した。
これらのプラスミドをスクリーニングするために、リン酸カルシウム法を用いてそれぞれpackaging plasmidとともにHeLa細胞にco-transfectionし、野生型アデノウイルスを感染させて、AAVを作製した。OTC2を用いて作製したAAV(以下AAV/OTC2)は3T3細胞を用いて力価測定したところ10^4cfu/mlであった。一方、OTC3を用いて作製した,AAV(以下AAV/OTC3)をdot blot法によりparticle数を測定したところ、10^5particle/mlであった。AAV/OTC2及びAAV/OTC3をそれぞれ2mlずつ10^6個のHepG2細胞にtransductionし、OTC活性を測定したところ、前者では測定感度以下であったが、後者では1.265μmol/mg protein/hrの活性が得られた。ここでAAV/OTC3を150ml作製しセルロースカラムを用いて濃縮したものを20μl用いて10^6個のHepG2細胞にtransductionしたが0.144μmol/mg protein/hrの活性しか得られなかった。次に高力価のrAAV vectorを作製するためにOTC2とpackaging plasmidのpackagin cell lineの作製を試みている。
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