| 研究課題/領域番号 |
09480154
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
11,500千円 (直接経費: 11,500千円)
1999年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
1998年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
1997年度: 5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
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| キーワード | トリプトファン合成酵素 / 構造ユニット / 分断酵素 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / TIMバレル / キメラ酵素 / ドメイン / タンパク質構造ユニット / ランダム変異 / trpA |
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| 研究概要 |
遺伝子工学手法を用いてタンパク質を分断し、その中から活性を保持している分断酵素を探索することによって、分断可能な部位を定め、タンパク質の機能および構造の単位を推論しようという研究を展開した。特に、一次配列上ランダムに切れ目を入れて立体構造の構成単位を探ることを目的として研究を開始した。このため、昨年までに酵素タンパク質をコードしている遺伝子上の任意の位置に停止コドン、開始コドンからなるリンカーを挿入する方法を開発した。大腸菌のトリプトファン合成酵素をモデル酵素タンパク質として、分断化ライブラリーを作成し、トリプトファンを欠く培地から選択することによって、酵素活性を保持している分断化酵素が取得できるようになった。今年度は多くの変異体を取得することに成功した。こうして、TIMバレル型の立体構造を持つトリプトファン合成酵素は多くの切断可能な部位を持つことが明らかとなった。得られた分断酵素の多くは二つのフラグメントが重複した部分を含んでおり、古典的なプロテアーゼを用いたニックを入れた酵素の場合とは異なる結果となった。切断点はループ部分に多く、これは予想されたとおりである。分断化酵素の精製も試みているが、成功には至っていない。一方、高度好熱菌のイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデルとして、そのドメイン構造を指標として、遺伝子に切れ目を入れることから分断酵素の調製を試みているが、発現産物が不安定なためか切断ペプチドが得られていない。なお、条件を検討中である。
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