| 研究課題/領域番号 |
09480166
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
山登 一郎 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (70111458)
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| 研究分担者 |
柿沼 善己 (柿沼 喜己 / 柿沼 喜巳) 千葉大学, 薬学部, 助教授 (80134394)
目黒 俊幸 東京理科大学, 基礎工学部, 助手 (20287478)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
9,600千円 (直接経費: 9,600千円)
1999年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1998年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1997年度: 5,600千円 (直接経費: 5,600千円)
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| キーワード | 液胞型ATPアーゼ / Na^+輸送性ATPアーゼ / 腸内連鎖球菌 / 精製と再構成 / Na^+結合反応 / 反応機構モデル / 耐塩性 |
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| 研究概要 |
当初の研究目的・実施計画を概ね遂行することが出来た。
1.腸内連鎖球菌クロモゾーム上の本酵素遺伝子の各サブユニット欠失異株の解析から、9つのサブユニット全てが必須であることが判明した。また、部位特異的変異導入を行い、Aサブユニットの活性部位付近に存在するCys残基の重要性とSH試薬感受性の相関関係を、Kサブユニットの保存性Glu残基近傍の一次構造がイオン輸送機能に厳密に必須であることを示すことが出来た。
2.再構成能のある精製標品を得、その生化学的研究を行った。活性複合体中、AからGとKとIのサブユニット全てを同定した。そのうち、サブユニットIとKが膜結合性であること、残りのサブユニットが遊離してくる触媒頭部に属することが判った。また、厳密にNa^+濃度依存であることなど酵素学的性質を調べた。
3.再構成系を用いて、本ATPアーゼが起電性の真にNa^+輸送性の活性を持つことを示すことが出来た。さらに、残りの膜結合(V_0)部分だけで膜電位依存の促進拡散的なNa^+透過活性を有することを示すことができた。
4.本オペロン調節領域にレポーター遺伝子(CAT遺伝子)を融合させたプラスミドを使用し、各種生育条件下の発現レベルの変化を調べ、アルカリpH及び細胞内Na^+濃度に依存して発現が制御されていることを示した。
5.精製標品を用い、Na^+やATP、ADPなど基質の結合活性を調べた。膜結合部分は、常にNa^+に対し高い親和性を持っていた。ATP添加により、その親和性が低下した。つまり、結合しているNa^+を膜の外側で遊離させる段階にATPのエネルギーを使用しているという反応機構を示すことができた。
6.本ATPアーゼV_1部分の精製系を確立した。X線結晶構造解析のため、V_1部分の結晶化条件を検討した。その結果、F_1部分結晶化と類似の条件が適当であると判断した。現在、本V_1部分精製標品の結晶化に成功している
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