微生物の遺伝学的類似度を測定する新しい方法論の作成に関する研究

• 研究課題/領域番号: 09557024
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 展開研究
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 江崎 孝行 岐阜大学, 医学部, 教授 (90151977)
• 研究分担者: 河村 好章 岐阜大学, 医学部, 助手 (80262757)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 9,500千円 (直接経費: 9,500千円); 1998年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円); 1997年度: 5,700千円 (直接経費: 5,700千円)
• キーワード: 分類 / 種の定義 / DNAハイブリッド / リボゾーム / 系統 / 液相ハイブリッド / リボソーム / 16S リボゾーム / DNA 相同性 / 種

研究概要

細菌は16SリボソームRNA配列により系統的に分類されてるようになったが,RNA配列が度の程度類似してれば同一種であるかといった概念は未だ完成されていない.我々は16SrRNA配列が99%以上類似している菌株間の遺伝学的類似度を測定し定量的DNA/DNAハイブリッドを使用しなければ菌種を最終的に決定できないことを証明してきた.
この染色体DNAのDNA/DNAハイブリッド法は従来固相法と液相法の2つの方法が実用化されているが,さまざまな方法論の問題点を抱えている.我々はマイクロプレートを使用した固相法を開発して使用してきたが,この方法はDNAの純度に左右されるため多糖体を大量に生産する菌のDNAには不向きであった.
DNAの純度を検定する方法として吸光度280/260>2.0という従来の基準を見直し多糖類の混入を定量化することによりDNAの純度を評価する指標を追加した.このことで実験の精度は上昇したが,DNAから多糖類を効率よく取り除く方法が必要となった.この対策としてキアゲンのDEAEシリカを使いNaClによる濃度勾配でDNAと多糖体を分けるプロトコールを作成した.
上記の方法でDNAの純度を上昇させることが出来たが,多糖を取り除く過程でDNAの損失も多く,糖類の混入があってもハイブリッド形成実験のデータが影響を受けない液相ハイブリッド法の開発も必要になった.この目的にはDNAをbiotin標識DNAを液体中でハイブリッドを系させStreptavidin magnet beadsを使用してハイブリッドを形成したDNAを選択した.その後,2本鎖DNAをSYBR Green 1を加え定量する方法を作成した.

研究成果

• [文献書誌] Kawamura,Y,et al.: "Genetic Approaches to the Identification of the Mitis Group within the genus Streptococcus." J.Microbiol.155in press. (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yabuuchi,E.et al.: "Emendation of Genus Achromobacter and Achromobacter xylosoxidans(Yabuuchi and Yano) and proposal of Achromobacter ruhlandii(Packer and Vishniac) comb.nov.〜" Microbiol.Immunol.42・2. 429-438 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hou XG,et al.: "Description of Arthrobacter creatinolyticus sp.nov.,isolated from human urine." Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 423-429 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawamura,Y,et al.: "Streptococcus peroris sp.nov.and Streptococcus infantis sp.nov.; new members of the Streptococcus mitis group,isolated〜" Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 921-927 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sultana,F.,et al.: "Determination of 23S rRNA Sequences from members of genus Streptococcus and Characterization of genetically distinct organisms previously identified as members of〜" FEMS Microbiol.Lett.158. 223-230 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hou,X.G.,et al.: "Genetic Identification of Members of the genus Corynebacterium at genus and species levels.with 16S rDNA targeted probes." Microbiol.Immun.41・6. 453-460 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawamura, Ezaki: "Genetic approaches to the identification of the mitis group within the genus Streptococcus." J.Microbiol.155 : (in Press). (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawamura, Y., X.G.Hou, , Y.Todome, F.Sultana, K.Hirose, K.S.E.Shu T.Ezaki and H.Okuni: "1998.Streptococcus peroris sp.nov.and Strepto-coccus infantis sp.nov. ; new members of the streptococcus mitis group, isolated from human clinical specimens." Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 921-927 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yabuuchi, E., Y.Kawamura, Y.Kosako, and T.Ezaki.: "Emendation of Genus Achromobacter and Achromobacter xylo-soxidans (Yabuuchi and Yano) and proposal of Achromobacter ruhlandii (Packer and Vishniac) comb.nov., Achromobacter piechaudii (Kiredjian et al.) Comb.nov., and Achromobacter xylosoxidans subsp.denitrificans (Ruger and Tan) comb.nov." Microbiol.Immunol.42. 429-438 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hou XG,Kawamura Y,Sultana F,Shu S,Hirose K,Goto K,Ezaki T @: "Description of Arthrobacter creatinolyticus sp.nov., isolated from human urine." Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 423-429 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sultana, F._AY.Kawamura, T.Ezaki: "Determination of 23S rRNA Sequences from members of genus Streptococcus and Characterization of genetically distinct organisms previously identified as members of Streptococcus anginosus group. FEMS Microbiol.Lett.158 : 223-230." FEMS Microbiol.Lett. 158. 223-230 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawamura Y., X.G.Hou, F.Sultana, K.Hirose, M.Miyake, S.Shu, and T.Ezaki: "Distribution of Staphylococcus species among human clinical specimens and emended description of Staphylococcus caprae.J.Clin.Microbiol.36 : 2038-2042." J.Clin.Microbiol.36. 2038-2042 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hou, X.G., Y.Kawamura, and T.Ezaki, et al.: "Genetic Identifi-cation of Members of the genus Corynebacterium at genus and species levels.with 16S rDNA targeted probes." Microbiol.Immun.41 (6). 453-460 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawamura,Y,et al.: "Genetic Approaches to the Identification of the Mitis Group within the genus Streptococcus." J.Microbiol.155(in press). (1999)
• [文献書誌] Yabuuchi,E.et al.: "Emendation of Genus Achromobacter and Achromobacter xylosoxidans (Yabuuchi and Yano) and proposal of Achromobacter ruhlandii (Packer and Vishniac) comb.nov〜" Microbiol.Immunol.42・2. 429-438 (1998)
• [文献書誌] Hou XG,et al.: "Description of Arthrobacter creatinolyticus sp.nov.,isolated from human urine." Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 423-429 (1998)
• [文献書誌] Kawamura,Y.,et al.: "Streptococcus peroris sp.nov.and Streptococcus infantis sp.nov.,new members of the Streptococcus mitis group,isolated〜" Int.J.Syst.Bacteriol. 48. 921-927 (1998)
• [文献書誌] Sultana,F.,et al.: "Determination of 23S rRNA Sequences from members of genus Streptococcus and Characterization of genetically distinct organisms previously identified as members of〜" FEMS Microbiol. Lett.158. 223-230 (1998)
• [文献書誌] Hou,X.G.,et al.: "Genetic Identification of Members of the genus Corynebacterium at genus and species levels.with 16S rDNA targeted probes." Microbiol.Immun.41・6. 453-460 (1997)
• [文献書誌] Hou.X.G.: "Genetic Identification of Members of the genus Corynebacterium at genus and species levels.with 16SrDNA targeted probes." Microbiol.Immun.41・6. 453-460 (1997)
• [文献書誌] Deguchi,T.: "Rapid screening of point mutation of the Neisseria gonorrhoeae parC gene associated with resistance to quinolones." J.Clin.Microbiol,. 35・4. 948-950 (1997)
• [文献書誌] Yasuda,M.: "Development and Clinical Application of a Polymerase Chain Reaction-Based Assay for Detecting Bacteroides ureolyticus." J Infect Chemother. 3. 150-153 (1997)
• [文献書誌] 古賀宏延: "Ligase Chain Reaction(LCR)法を用いた結核菌群DNA検出試薬の臨床的検討" 感染症学雑誌. 71. 1246-1251 (1997)
• [文献書誌] Sultana,F: "Determination of 23SrRNA Sequences from members of genus Streptococcus and Characterization of genetically distinct organisms previously identitied as members" FEMS Microbiol.Lett.158. 223-230 (1998)
• [文献書誌] Kawamura,Y.: "Streptococcus peroris sp.nov. and Streptococcus infantis sp.nov.;new members of the Streptococcus mitis group,isolated from human clinical specimens." J.Syst.Bacteriol,. (in press). (1998)