| 研究課題/領域番号 |
09557217
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
病態検査学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
上田 國寛 京都大学, 科学研究所, 教授 (00027070)
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| 研究分担者 |
北川 幸一郎 ダコジャパン(株), 研究開発部, 部長
木戸 隆宏 京都大学, 医療技術短期大学部, 助手 (60234308)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
12,400千円 (直接経費: 12,400千円)
1999年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
1998年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
1997年度: 6,800千円 (直接経費: 6,800千円)
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| キーワード | PNAプローブ / MRSA / CSA法 / PNA-CSA法 / IM-PCR法 / in situ PCR法 / 直接PCR法 / Ampdirect / ペプチド核酸 / 遺伝子診断 / mecA / in situ PCR / 点変異 / K-ras / 結核菌 / mec A / 16S rRNA / PNA / 黄色プドウ球菌 |
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| 研究概要 |
I.PNAのプローブとしての特性の解析・・・・・・まず、PNA(ペプチド核酸)プローブのもつ物理化学的、生物学的特性を、MRSA(メチシリン耐性黄色ブトウ球菌)と結核菌を対象として検討した。これにより、PNAプローブのもつ特性(高い細胞膜透過性と配列特異性、強いDNA結合能)を確認したが、同時に、感度が臨床応用には不十分で、シグナル増幅の必要がある、という重大な問題点を見出した。
II.PNA-CSA法の開発・・・・・・Iで明らかとなった感度の問題を解決するため、PNAプローブに、チラミンの酸化(ラジカル化)を応用したCSA(Catalyzed Signal Amplification)法を組み合わせた方法の開発を進めた。この新しい方法(PNA-CSA法)をMRSAのmecA遺伝子に適用した結果、MRSAを数コピーまで特異的に検出できることが明らかとなった。これは、DNAやPNAプローブによる従来法に比較すると、大幅な感度向上である。
III.高感度IM-PCR法の開発・・・・・・PNA-CSA法と平行して、IM-PCR(インターカレーション・モニタリングPCR)法の開発をおこなった。すなわち、PCRによって増幅する2本鎖DNAにインターカレートする色素の蛍光をリアルタイムに測定する方法で、これにより数十コピーのHCVの検出が可能となった。
IV.in situ PCR法の改良・・・・・・肺癌患者の肺組織中の変異K-ras遺伝子を指標に、反応条件の詳細な検討をおこなった。その結果、病理標本上で単一コピーの点突然変異を検出できる目途が立った。
V.Ampdirect^<TM>による生体試料からの直接PCR法の開発・・・・・・Ampdirect^<TM>を糞便および血液に適用し直接PCR法をおこなった結果、従来のPCRバッファーに比較して、圧倒的に良好な増幅が得られることが明らかとなった。
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