| 研究課題/領域番号 |
09558081
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
11,800千円 (直接経費: 11,800千円)
1999年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
1998年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1997年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
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| キーワード | イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / RNAポリメラーゼ / Tagポリメラーゼ / 進化分子工学 / 低温適応 / Taqポリメラーゼ / 高度好熱菌 / PCR / 耐熱酵素 / 実験室内進化 / Thermus thermophilus / 進化的分子工学 / leuB |
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| 研究概要 |
遺伝子工学手法を用いて実験室内進化の系を考案し、モデル酵素タンパク質、さらに平行して最終目的であるDNA関連酵素を改変し、高活性でかつ耐熱性の酵素を創製することを目的に、高度好熱性細菌の酵素を常温適応させること、逆に常温酵素を進化的に耐熱化することを試みた。すでに昨年成功したように、高度好熱菌Thermus thermophilusのイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデル酵素として常温に適応させると、ある場合には高い耐熱性を維持したまま、常温での活性が著しく改善できることが分かった。今年度はさらに多くの高活性、高安定な変異体の分種に成功した。その機構を探るために、タンパク質工学的な研究を展開した。すなわち、得られた変異体の変異部位を他のアミノ酸残基に置換し、側鎖の置換の効果を解析した。同様な手法を用いて、RNAポリメラーゼの改良を試みている。目的遺伝子を高度好熱菌の主染色体に組み込み、RNAポリメラーゼ用のプロモーターの下にマーカー遺伝子をつなぐ系を試みているが、その改良として同一プラスミド上に両者を乗せる系を開発した。現在も探索中である。同様にPCRに用いられているTaqポリメラーゼの改良も試みている。同酵素をコードする遺伝子を保持する大腸菌用いてランダムライブラリーを作りの分断し、その中から特定の活性を保持している変異体をスクリーニングしている。今なお、条件を検討中である。
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