| 研究課題/領域番号 |
09660091
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
喜多 恵子 鳥取大学, 工学部, 助教授 (70234226)
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| 研究分担者 |
片岡 道彦 京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (90252494)
清水 昌 京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (70093250)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1998年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1997年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | 光学活性アルコール / 酵母 / cDNAクローニング / アルデヒド還元酵素 / グルコース脱水素酵素 / NADPH結合 / キラルシントン / NADPH / 部位特異的変異 |
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| 研究概要 |
赤色酵母Sporobolomyces salmonicolor(AKU4429)の生産する、Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoateを立体選択的に ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateへ還元する酵素(ALR(S))をクローニングするため、酵素を均一に精製して、N末端および内部アミノ酸を合計65残基決定した。得られた配列をもとにプライマーを合成して、染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、増幅された断片をプローブとして用いて、染色体DNAライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性クローンの塩基配列解析の結果、イントロンの存在が示唆されたので、mRNAを鋳型としてRT-PCRを行い、ALR(S)のcDNAを特異的に増幅した。本酵素遺伝子は1,032bpから成り、344アミノ酸残基(分子量37,325)から構成されることを明らかにした。大腸菌を宿主とするAR2大量発現系から組換え体酵素を均一に精製して、酵母由来の酵素と同一の触媒活性を示すことを明らかにした。組換え体大腸菌を光学活性アルコール合成の触媒素子として用いるために、Bacillus megateriumIWG3株由来のグルコース脱水素酵素(GDH)とALR(S)遺伝子の共発現系の構築を行った。両酵素遺伝子を同一ベクターにタンデムに連結した組換え体プラスミドを保持する大腸菌が、両酵素活性ともに高く、プラスミドの安定性も優れていることを明らかにした。また、ALR(S)の推定一次構造から、補酵素NADPHとの結合に関与するアミノ酸を推定し、部位特異的変異を行った結果、G19とG22がNADPHとの結合に深く関与しており、A25G変異酵素は、NADPHに加えNADHに対しても活性を示すことを見い出した。
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