凍結割断レプリカ免役標識法による膜チャンネルとトランスポーターの動態解析

• 研究課題/領域番号: 09670008
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 解剖学一般(含組織学・発生学)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 藤本 和 京都大学, 医学研究科, 講師 (50159125)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 1998年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 1997年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: チャンネル / 細胞膜 / 電子顕微鏡 / フリーズフラクチャー / 免疫標識 / アストロサイト / 免疫電顕 / アクアポリン / 生体膜 / 凍結割断レプリカ / チャネル / レセプター

研究概要

細胞内へあるいは細胞内から外へのイオンや糖などの物質の移動は,細胞膜に存在するイオンポンプ,チャンネルやトランスポーターによって受動的あるいは能動的に行われている.通常,これらのポンプやチャンネルは恒常的に細胞膜に存在し,ホルモンなどのリガンド刺激によって,活性化され,ポンプによって細胞内からイオンがくみ出されたり,チャンネルが開き,イオンが通過できるようになる.しかし,通常は細胞内に存在する膜小胞の膜に存在し,刺激に応じて,この小胞膜が細胞膜に融合することによって,細胞膜に組み込まれ,その機能を発現するチャンネルやトランスポーターも存在することが知られている.代表的なものとしては,インシュリン感受性のグルコーストランスポーターや水チャンネルであるアクアポリン(aquaporin,AQP)がある.
最近,私たちは通常の方法で作成した凍結割断プラチナ-カーボンレプリカ膜を免疫コロイド金標識する方法を考案し,良好な結果を得ている.本申請研究では,小脳星状膠細胞(アストロサイト)における水チャンネル,アクアポリン(aquaporin)の動態を凍結割断レプリカ免疫標識法で観察し,この分子の動態や機能にグルタミン酸受容体が密接に関係していることを明らかにした.

研究成果

• [文献書誌] Fujimoto, K.et al.: "A simple and reliable quick-freezing/freeze-fracturing procedure." Histochem. Cell Biol.,. 107. 81-84 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.: "SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral-membrane protein and phospholipids in biomembranes : practical procedure, interpretation and application." Histochem. Cell Biol.,. 107. 87-96 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.: "mmunoelectron microscopy of protein kinase C in resting and phagocytosing macrophages." Acta histochem. cytochem.30. 105-111 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.: "Dynamics of connexins, E-cadherin and a-catenin on cell membranes during gap junction formation." J.Cell Sci.110. 311-322 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 藤本 和: "SDS処理凍結割断レプリカ標識法-補講- : 急速凍結/凍結割断法、ならびに膜蛋白質のトポロジー解析と膜リン脂質の検出について" 電子顕微鏡. 32. 48-51 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fujimoto. K.: "Immuno-labeling of freeze-fracture replica." Micron. in press. (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.et al.: "A simple and reliable quick-freezing/freeze-fracturing procedure." Histochem.Cell Biol.107. 81-84 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto.K.: "SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes : practical procedure, interpretation and application." Histochem.Cell Biol.107. 87-96 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.et al.: "Dynamics of connexins, E-cadherin and a-catenin on cell membranes during gap junction formation." J.Cell Sci.110. 311-322 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, T.and Fujimoto, K.: "Metal sandwich method to quick-freeze monolayer cultured cells for freeze-fracture." J.Histochem.Cytochem.34. 595-598 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto, K.et al.: "Immunoelectron microscopy of protein kinase C in resting and phagocytosing macrophages." Acta histochem.cytochem.30. 105-111 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hirase, T.et al.: "Occludin as a possible determinant of tight junction permeability in endothelial cells." J.Cell Sci.110. 1603-1613 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Saitou, M.et al.: "Mammalian occludin in epithelial cells : its expression and subcellular distribution." Eur.J.Cell Biol.73. 222-231 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Moller, J.V.et al.: "Probing of the membrane topology of sarco-plasmic reticulum Ca2+-ATPase with sequence specific antibodies : Evidence for plasticity of the C-terminal domain." J.Biol.Chem.272. 29015-29032 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Saitou, M.et al.: "Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions." J.Cell Biol.141. 397-408 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Moroi, S.et al.: "Occludin is concentrated at tight junctions of mouse/rat but not human/guinea pig Sertoli cells in testes." Am.J.Physiol.274. C1708-17 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Morita, K.et al.: "Subcellular distribution of tight junction-associated proteins (Occludin, ZO-1 and ZO-2) in rodent skin." J.Invest.Dermatol.110. 862-866 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Furuse, M.et al.: "Claudin-1 and -2 : novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin." J.Cell Biol.141. 1539-1550 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Watabe-Uchida, M.et al.: "a-catenin-vinculin interaction functions to organize the apical junctional complex in epithelial cells." J.Cell Biol.142. 847-857 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Furuse, M.et al.: "A single gene product, claudin-1 or-2, reconstitutes tight junction strands and recruits occludin in fibroblasts." J.Cell Biol.143. 391-401 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Morita, K.et al.: "Claudin multigene family encoding four-trans-membrane domain protein components of tight junction strands." Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96. 511-516 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto. K.: "Immuno-labeling of freeze-fracture replica." Micron. (in press). (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fujimoto,K.et al.: "A simple and reliable quick-freezing/freezu-fracturing procedure." Histochem.Cell Biol.107. 81-84 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.: "SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes:practical procedure,interpretation and application." Histochem.Cell Biol.107. 87-96 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.: "Immunoelectron microscopy of protein kinase C in resting and phagocytosing macrophages." Acta histochem.cytochem.30. 105-111 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.: "Dynamics of connexins,E-cadherin and a-catenin on cell membranes during gap junction formation." J.Cell Sci.110. 311-322 (1997)
• [文献書誌] 藤本 和: "SDS処理凍結割断レプリカ標識法-補講-:急速凍結/凍結割断法、ならびに膜蛋白質のトポロジー解析と膜・リン脂質の検出について" 電子顕微鏡. 32. 48-51 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.: "Immuno-labeling of freeze-fracture replica." Micron. (in press). (1999)
• [文献書誌] Fujimoto.K.et al.: "A simple and reliable quick-freezingl freeza-fracturing procedure." Histochem.Cell Biol.107・1. 81-84 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.et al.: "Dynamics of connexins,E-cadherin and α-catenin on cell membranes during gap junction formation." J.Cell.Sci.110・3. 311-322 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.: "SDS-digested freeza-Fracture replica labeling electron micro scopy to study the two-dimensional distribution of integral membrame protetus and Phospholipid." Histochem,Cell Biol.107・2. 87-96 (1997)
• [文献書誌] Hirase,T.et al,: "Occludin as a posstble,. determinart of tight Jumcton permeability in andothelral cells." J.Cell Sci.110・17. 1603-1613 (1997)
• [文献書誌] Fujimoto,K.et al.: "Immunoelectron microscopy of protein kinase C in resting and phagocytosing marophages." Acta histochem.cytochem.30・1. 105-111 (1997)
• [文献書誌] Muller,J.V.et al.: "Probing of the membrane topdogy of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase with sequence specific antibodies." J.Biol.Chem.272・9. 29015-29032 (1997)
• [文献書誌] 藤本 和: "組織細胞化学1997" 日本組織細胞化学会, 11 (1997)