| 研究課題/領域番号 |
09670115
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
薬理学一般
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
川西 徹 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (40124383)
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| 研究分担者 |
石井 明子 (渡部 明子) 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 研究員 (50291117)
内田 恵里子 (内田 恵理子) 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (80176685)
河合 洋 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 研究員 (20321854)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1998年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1997年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | チロシンリン酸化 / SH2ドメイン / 蛍光プローブ / GFP / FRET / 蛍光顕微鏡 / SHドメイン / 画像解析 / src-類似領域 |
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| 研究概要 |
タンパク質チロシンリン酸化を捉えるための蛍光プローブ開発を目的として研究を行なった。まず pEGFP-N、-Cベクター(Clontech)にGrb2/Ash、PLCγ1のSH2ドメインを組み込み、各種GFP-SH2発現ベクターpEGFP-SH2を作製した。これらを大腸菌で発現させ、GFPと同じ蛍光特性を有する融合タンパク質4種を得た。しかしpEGFP-SH2を HeLa、RBL-2H3、HepG2等に導入、発現は確認できたが、リン酸化刺激による再現性のある顕著な蛍光局在の変化は観察されなかった。
そこで蛍光特性の異なるGFP変異体 (CFP、YFP)間のFRETを利用して、リン酸化を蛍光波長の変化としてとらえるプローブ作製を試みた。CFP-SH2(Grb2/Ash)-YFP、YFP-SH2(Grb2/Ash)-CFP、YFP-SH2(PLCγ1)-CFP発現プラスミドを作製した。これら融合タンパク質を評価するため、EGF受容体やPDGF受容体βの配列中のSH2ドメインによって認識されるチロシン残基を中心とした20残基のペプチド、およびそのチロシンリン酸化ペプチドを化学合成した。大腸菌に発現させて得た各YFP-SH2-CFPを合成ペプチドとインキュベートし、チロシンリン酸化の有無による蛍光変化を測定したところ、YFP-SH2(PLCγ1)-CFPで変化がみられた。さらにもう一つの試みとして、チロシンリン酸化の基質となる配列(EGF受容体、PDGF受容体等)のN末端、C末端にCFP、YFPを持つ融合タンパク質発現プラスミドを作製した。発現させたこれら融合タンパク質を細胞(HeLa、RBL-2H3等)溶解液、ATP、EGF(PDGF)とともにインキュベートしてチロシンリン酸化反応にともなう蛍光変化を測定したところ、CFP-(PDGF受容体のチロシンリン酸化部位±10残基)-YFPにおいて、ATP濃度依存的な蛍光変化(527nm/475nmの減少)が観察された。以上の作製した各種プラスミドを各種細胞に導入し融合タンパク質を発現させ、画像取得しているが、細胞内ではリン酸化刺激に伴う蛍光変化の検出には成功していない。
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