線虫を用いた新規Ras標的蛋白質の解析と全標的蛋白質の遺伝子破壊

• 研究課題/領域番号: 09670128
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 医化学一般
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 苅谷 研一 神戸大学, 医学部, 助教授 (40263371)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円); 1998年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 1997年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 線虫C.elegans / Ras癌遺伝子 / Tow-Hybrid法 / 遺伝子ノックアウト / RalGDS / AF-6 / Cdc25 / phospholipase C / Two-Hybrid法 / Cds25

研究概要

1, 新規Ras標的蛋白質の解析:Two-Hybrid法を用いて線虫Ras込結合蛋白質を検索し,哺乳動物で知られていたRaf,RalGDS,AF6に加え新規標的候補としてphospholipase C (Ce-PLC210)とGDP/GTP交換因子(Ce-Cdc25)を見い出した。これらは野生型RasとRap1A(Rasホモログ)には結合したが,エフェクター領域変異体やRal,Rho,Rac,Cdc42には結合しなかった。後二者についてはヒトホモログ(Hu-PLC210,-Cdc25)をも単離した。Hu-PLC210はCe-PLC210と同様にRas,Rap1AにGTP依存性に結合し,PIP2を加水分解した。Hu-Cdc25はRap1AにのみGTP依存性に結合し,Rap1Aに対して強いGDP/GTP交換活性を示したが,Rasに対しても弱い活性を持っていた(Ce-Cdc25はRas,Rap1A両方に対し同等の活性を示した)。Hu-Cdc25は,細胞外シグナルにより活性化された(GTP型)Rap1Aに結合することで膜にリクルートされ,近傍のGDP型Rap1Aを活性化するのではないかと考えている。
2, 全標的遺伝子の破壊,3,表現型の解析と,4,遺伝学的解析:Raf以外の全標的遺伝子につきトランスポゾン挿入変異体を単離し,Ce-Cdc25以外は遺伝子欠損変異体も単離した。PLC210遺伝子破壊変異体は不妊(EGF受容体変異体の表現型の一つに類似)と産卵障害(Rasの変異体の表現型の一つに類似)を示し,これらの表現型は,同遺伝子のトランスジェニック発現により相補された。一方,Rafにより制御される陰門形成は,どの変異体でも正常であった。また,Rafの不活性型変異はRasの活性型変異による陰門過形成を抑制するが,PLC210,RalGDS,AF6のどの変異もこれを抑制しなかった。
5, Ce-FLI-1の解析:出芽酵母のRas標的(アデニル酸シクラーゼ)のRas結合ドメインに酷似したドメインを持つ線虫蛋白質Ce-FLI-1について,そのRas結合活性,アクチン結合・切断活性を証明した。

研究成果

• [文献書誌] Kariya,K.,et al.: "C.elegans homologs of ralGDS,AF-6,Cdc25 and phospholipase Cβ interact with Let-60" Worm Breeder's Gazette. 14・5. 34-35 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hu,C.-D.,et al.: "Coassociation of Rap 1A and Ha-Ras with Raf-1 N-terminal region interferes with Ras-dependent activation of Raf- 1" J.Biol.Chem.272・18. 11702-11705 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shibatohge,M.,et al.: "Identification of PLC210,a Caenorhabditis elegans phospholipase C,as a putative effector of Ras" J.Biol.Chem.273・11. 6218-6222 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Watari,Y.,et al.: "Identification of Ce-AF-6,a novel Caenorhabditis elegans protein,as a putative Ras effector" Gene. 224・1-2. 53-58 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hu,C.-D.,et al.: "Effect of phosphorylation on activities of Rap 1A to interact with Raf-1 and to suppress Ras-dependent Raf- 1 activation" J.Biol.Chem.274・1. 48-51 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Goshima,M.,et al.: "Characterization of a novel Ras-binding protein Ce-FLI-1 comprising leucine-rich repeats and gelsolin-like domains" Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kariya, K.et al.: "C.elegans homologs of ralGDS,AF-6, Cdc25 and Phospholipase Cbeta interact with Let-60." Worm Breeder's Gazette. 14-5. 34-35 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hu, C.-D.et al.: "Coassociation of RaplA and Ha-Ras with Raf-1 N-terminal region interferes with Ras-dependent activation of Raf-1." J.Biol.Chem.272-18. 11702-11705 (1997)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shibatohge, M.et al.: "Identification of PLC210, a Caenorhabditis elegans phospholipase C,as a putative effector of Ras." J.Biol.Chem.273-11. 6218-6222 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Watari, Y.et al.: "Identification of Ce-AF-6, a novel Caenorhabditis elegans protein, as a putative Ras effector." Gene. 224-1-2. 53-58 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hu, C.-D.et al.: "Effect of phosphorylation on activities of Rap1A to interact with Raf-1 and to suppress Ras-dependent Raf-1 activation." J.Biol.Chem.274-1. 48-51 (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Goshima, M.et al.: "Characterization of a novel Ras-binding protein Ce-FLI-1 comprising leucine-rich repeats and gelsolin-like domains" Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1999)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shirouzu,M.,et al.: "Interactions of the amino acid residue at position 31 of the c-Ha-Ras protein with Raf-1 and RalGDS" J.Biol.Chem.273・13. 7737-7742 (1998)
• [文献書誌] Ohnishi,M.,et al.: "Selective inhibition of Ras interaction with its particular effector by synthetic peptides corresponding to the Ras effector region" J.Biol.Chem.273・17. 10210-10215 (1998)
• [文献書誌] Nishida,Y.,et al.: "Coiled-coil interaction of N-terminal 36 residues of cyclase-associated protein with adenylyl cyclase is sufficient for its function in Saccharomyces cerevisiae Ras pathway" J.Biol.Chem.273・43. 28019-28024 (1998)
• [文献書誌] Watari,Y.,et al.: "Identification of Ce-AF-6,a novel Caenorhabditis elegans protein,as a putative Ras effector" Gene. 224・1-2. 53-58 (1998)
• [文献書誌] Hu,C.-D.,et al.: "Effect of phosphorylation on activities of RaplA to interact with Raf-1 and to suppress Ras-dependent Raf-1 activation" J.Biol.Chem.274・1. 48-51 (1999)
• [文献書誌] Goshima,M.,et al.: "Characterization of a novel Ras-binding protein Ce-FLI-1 comprising leucine-rich repeats and gelsolin-like domains" Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press).
• [文献書誌] Kariya,K.,et al.: "C.elegans homologs of ralGDS,AF6,Cdc25 and phospholipase Cβ interact with Let-60" Worm Breeder′s Gazette. 14・5. 34-35 (1997)
• [文献書誌] Shibatohge,M.,et al.: "Identification of PLC210,a Caenorhabditis elegans phospholipase C,as a putative effector of Ras" J.Biol.Chem.273. 6218-6222 (1998)