| 研究課題/領域番号 |
09670226
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
実験病理学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
北澤 荘平 神戸大学, 医学部, 講師 (90186239)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
1998年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1997年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | プロモータ / 遺伝子発現 / サイクリンD1 / CpG Locus / サイクリンD_1 / CpG Island / メチル化シトシン / レポータ遺伝子 / 遺伝子導入 / ラット / 遺伝子クローニング |
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| 研究概要 |
I) サイクリンD1遺伝子5'側上流CpG islandのメチル化部位の特定
CpG islandのメチル化をSodium Bisulfite処理後、PCR法を用いたDNA塩基配列決定で塩基単位で決定した。Steady-stateにおけるサイクリンD1遺伝子発現の高い細胞(K4DT)では、サイクリンD1遺伝子5'側上流にある2つのSp1サイトにはメチル化が見られないのに対し、Steady-stateにおけるサイクリンD1遺伝子発現の低い細胞(K4D、K3D)では複数のシトシンにメチル化が観察された。
II) CpG islandのメチル化、脱メチル化の違いによるDNA結合蛋白の変化の解析
2つの近接したCpG islandに挟まれたE2F結合部位に焦点を絞って検討した。この領域は約200bp程度の長さのDNAで、PCR法により増幅した。メチル化酵素によってシトシンをメチル化したものを作成し、E2Fとの結合性、親和性を検討した。E2Fとの結合性はメチル化によって影響を受けず、上記I)によって得られたSp1との親和性の違いによってメチル化はサイクリンD1遺伝子発現を調節していることが推定された。
III) 高感度なメチル化部位の特定法の改良
少数の細胞からも特定部位のメチル化が検出できるように低温融解性アガロースのビーズを用いた実験系を開発した。in vivoでの実験で得られた少数の細胞(パラフィン切片より選別)においてもメチル化シトシンの検出が可能であった。
IV) サイクリンD1遺伝子発現と細胞接着性との関連
血球系細胞においては、細胞の接着性を制御しているという仮説の下に、細胞接着分子のなかで、特にインテグリンの発現状態の検討を行った。α4インテグリンサブユニットに対する抗体を用いた免疫沈降法にて、細胞亜株間で、サイクリンD1遺伝子発現量と相関して特異的にα4インテグリンサブユニットの発現上昇を認めた。
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