C型肝炎ウイルスによる細胞のインターフェロン耐性の機構解析-IFNで誘導される二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼの活性調節-

• 研究課題/領域番号: 09670585
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 消化器内科学
• 研究機関: 金沢医科大学
• 研究代表者: 伊達 孝保 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50019676)
• 研究分担者: 松井 理 金沢医科大学, 医学部, 助手 (60288272) ; 堤 幹宏 金沢医科大学, 医学部, 助教授 (00155425)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 1998年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 1997年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
• キーワード: C型肝炎ウイルス(HCV) / インターフェロン / 二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ(PKR) / NS5A / コアタンパク質 / 二本鎖RNA(dsRNA) / 二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR) / ゲルシフトアッセイ / two hybrid system / ISDR / GST融合タンパク質

研究概要

C型肝炎ウイルス(HCV)がインターフェロン(IFN)抵抗性を発揮する上で非構造タンパク質NS5Aと構造タンパク質であるコアタンパク質の両方が重要な役割を果たしている結果を得た.
1. 複数のINF抵抗性HCV株からコアタンパク質とNS5A部分をコードするcDNAを得た.
2. NS5Aタンパク質を餌にした酵母two hybrid systemによるスクリーニングにより,IFNで誘導される二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ(PKR)を見つけた.大腸菌発現PKRを作製し,これを用いて試験管内でのPKRによる自己リン酸化活性の影響を調べたところNS5Aによる阻害効果を認めた.
3. しかしながら,NS5Aだけではインターフェロン抵抗性は説明できないため,コアタンパク質に着目し,活性ゲル法とゲルシフトアッセイによりコアタンパク質のRNA結合能を解析してみた.するとコアタンパク質は一本鎖RNAに対する結合は弱く,二本鎖RNAに強く結合することがわかった.またその結合様式は塩基配列非依存性であった.
4. コアタンパク質の二本鎖RNAに対する親和性を組み換え体PKRのそれと比較したところ,コアタンパク質の親和性はPKRとほぼ同程度で,定数はPKRの1/2〜1/4倍程度であった.
5. このことからPKRに対するコアタンパク質の影響を調べるた.そのために二本鎖RNAに依存してリン酸化活性を示すPKRを作製した.試験管内でコアタンパク質のPKR活性化活性に対する阻害効果を,二本鎖RNA存在下で調べたところ,コアが強くPKRの活性を抑制しすることを見つけた.このことは,HCVがIFN抵抗性を示す上でウイルスがコードするNS5Aとコアタンパクが重要な役割を果たしている.