| 研究課題/領域番号 |
09671086
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
内分泌・代謝学
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| 研究機関 | (財)沖中記念成人病研究所 |
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研究代表者 |
中西 幸二 (財)冲中記念成人病研究所, 研究員 (80211423)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1998年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1997年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | インスリン依存型糖尿病 / MHC抗原 / 抗原ペプチド |
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| 研究概要 |
インスリン依存型糖尿病(IDDM)はMHC抗原が関与する自己免疫疾患である。MHC抗原は抗原ペプチドをT細胞に提示するが、この抗原ペプチドのモチーフはそのMHC抗原特異的である。本研究の目的はIDDM感受性のMHC抗原がどのような膵ラ氏島由来の抗原ペプチドを提示するのかを明らかにすることである。
IDDM患者の末梢血よりのB細胞株をローラーボトルを用いて大量培養を行い、一方は培養液のみ、もう一方には胎児膵ラ氏島細胞株の破砕物を加えた。両者をNP-40を含むlysis buffer にて処理し、affinity chromatography にかけ、HLA-DR分子、HLA-DQ分子を得た。次に、得られたHLA-DR分子、HLA-DQ分子をtrifluoroacetic acidで処理し、限外濾過によりペプチドを分離した。さらに、これを逆相HPLCにかけ分離した。
HLA-DR分子とHLA-DQ分子より分離された抗原ペプチドはHPLCによりピークとして分取された。培養液のみの培養系と胎児膵ラ氏島細胞株の破砕物のパルスした培養系のHPLCの溶出パターンを比較するとHLA-DR分子で培養系と胎児膵ラ氏島細胞株の破砕物のパルスにより特異的に現れた3つのピークが得られた。このピークに含まれるペプチドをエドマン分解法にてシークエンシングしたところ、一つのピークよりアミノ酸14個よりなるペプチドが検出できた。Homology検索にて元の蛋白も同定できた。
胎児膵ラ氏島細胞株よりこの蛋白のcDNAをRT-PCRで得、TA cloningのあとexpression vector pTrcHisAに組み込み、大腸菌を用いてIPTG誘導下蛋白を発現させ、SDS-PAGE、Western blottingにて蛋白の検出を行ったが未だ目指す蛋白の発現には至っていない。現在新たな系にて発現を検討中である。
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