| 研究課題/領域番号 |
09671254
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
外科学一般
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
片山 時孝 東海大学, 医学部, 助手 (40214332)
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| 研究分担者 |
上山 義人 東海大学, 医学部, 助教授 (30072408)
猪口 貞樹 東海大学, 医学部, 助教授 (60160008)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
1999年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1998年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1997年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 初代培養 / ヒト肝細胞 / アデノウイルスベクター / 不死化 / SV40T抗原 / ハイブリッド型人工肝臓 / 初代培養用細胞 / 遺伝子導入 / 形質転換コロニー / 初代培養肝細胞 |
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| 研究概要 |
【目的】初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人口肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサルの初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させ得ること、長期培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みた。
【方法・結果】1.組み替えウイルスベクター感染後のSV40T抗原一過性発現率はMOI(multiplicity of infection)に依存性であった。2.組み替えウイルスベクター感染後の形質転換コロニー形成率は10^6個に対して約100個の形質転換コロニーが出現した。3.長期継代培養と不死化:形質転換コロニーを6ヵ月以上長期継代培養し不死化したと考えられる肝細胞は18ヵ月以上良好に増殖している。4.Urea合成能およびチロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)活性は長期継代培養していくと経時的に低下していくことが判明した。5.SCID mouseへの移植によりこの不死化肝細胞が癌化しないことを確認した。6.poly-N-p-vinylbenzyl-β-D-lactonamide(PVLA)修飾シャーレ上での3次元培養を試みた。PVLA修飾シャーレ上での単層培養は安定し行えているが、3次元培養は安定して行えていない。これには密度の問題が関与していると考えられる。至適3次元培養の条件を検討中である。
【結語】単層培養では経時的に肝細胞機能が減弱していくことが平成10年度の研究で明らかとなった。このため今後は、機能をよりよく温存する可能性が高い高密度3次元培養を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。
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