末期肝不全・先天異常等による肝実質細胞機能不全に対する細胞療法の開発

• 研究課題/領域番号: 09671270
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 外科学一般
• 研究機関: 国立小児病院(小児医療研究センター)
• 研究代表者: 絵野沢 伸 国立小児病院, 小児医療研究センター・実験外科生体工学部, 室長 (40232962)
• 研究分担者: 奥山 虎之 国立小児病院, 小児医療研究センター・先天異常研究部, 室長 ; 李 小康 国立小児病院, 小児医療研究センター・実験外科生体工学部, 科学技術庁特別研究員 ; 鈴木 盛一 国立小児病院, 小児医療研究センター・実験外科生体工学部, 部長 (00111386) ; LI Xiao-Kang NATIONAL CHILDREN'S MEDICAL RESEARCH CENTER, DEPARTMET OF EXPERIMENTAL SURGERY, POSTDOCTORAL FELLOW
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 1998年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 1997年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 肝不全 / 細胞療法 / 遺伝子導入 / 肝細胞増殖 / 肝細胞分化 / 肝上皮幹細胞 / 羊膜細胞 / 免疫抑制

研究概要

末期肝不全あるいは肝細胞の先天性代謝異常症の新規な治療法としての細胞移植による肝組織再構築を目的として、1)肝上皮幹細胞の探索、2)肝細胞分化誘導因子の探求、3)細胞への遺伝子導入による機能付与、4)移植細胞生着のための免疫抑制、の面から研究を遂行している。初年度には仔ブタ肝細胞の増殖性肝細胞を利用しUDP-glucuronosyltransferase欠損ラット(GUNNラット)に対する細胞移植治療を行い、同ラットの高ビリルビン血症を軽減することができた。本年度は、新たな肝幹細胞様の性質を示す細胞ソースとしてヒト羊膜細胞に着目しin vitro、in vivoで検討を重ねた(ヒト材料の取扱いに先立ち国立小児病院倫理委員会に申請し、許可条件に基づき実験を行った)。帝王切開で得られた胎盤から分離されたヒト羊膜組織はアルブミン陰性であるが、培養経過と共にアルブミン、α-フェトプロテイン陽性に変化する。アルブミンについてはRT-PCRでmRNAの検出、ELISAで培養上清中の分泌タンパクの検出を行った。この組織をScidマウス肝へ移植したところ生着し肝組織構築に取り込まれた。この性質を利用し、上記GUNNラットへUDP-glucuronosyltransferase遺伝子を導入した羊膜細胞の移植による治療実験を試みている。
肝実質細胞はin vitro培養系で速やかに分化機能を喪失するが、本年度は、種々の細胞との共培養及びラット胎児ホモジネートを用いることで分化機能の長期維持を試みた。共培養した細胞は、ヒト羊膜細胞、温度感受性SV40遺伝子導入ラット肝細胞株(IGRH)を用いた。ラット胎児ホモジネートは胎齢16日±1日を用い、ラット血漿を加えることによりゲル化させ、ゲル内で肝細胞を培養した。これらの条件下で肝細胞は本来の形態をよく維持しながら最長30日程度培養できた。また、分化機能の指標としてアンモニア除去能を調べたところ、ラット胎児ホモジネートゲル内培養で20日程度に及ぶ機能維持を見た。現在この機能維持因子を分画している。
移植細胞生着のための免疫抑制についてはアポトーシス関連遺伝子、特にFas-L遺伝子の導入による免疫抑制療法を検討した。Fas-L遺伝子の導入により移植肝の生着日数は対照の約3倍程度に延長することがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Enosawa S et al.: "Higher efficiency of retrovirius transduction in the late stage of primary culture of hepatocytes from non-treated than from partially hepatectomized rat"Cell Transplantation. 7(4). 413-416 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Li XK et al.: "Prolonged survival of rat liver allografts transfected with Fas-ligand expressing plasmid"Transplantation. 66(11). 1416-1423 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yata Y et al.: "In vivo Administration of Dichloromethylene Diphosphate(CL2MDP)to Obtain Highly Purifide Hepatic Stellate Cells in Rats"Methods in Cell Science. in press.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Enosawa S, Suzuki S. Li XL, Okuyama T, Fuiino M, Amemiya H.: "Higher efficiency of retrovirus transduction in the late stage of primary culture of hepatotes from non-treated than from partially hepatectomized rat"Cell Transplantation. 7(4). 413-416 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Li XL. Okuyama T, Tamura A, Enosawa S, Kaneda Y Takahara S, Funeshima N, Yamada M. Amemiya H, Suzuki S.: "Prolonged survival of rat liver allografts transfected with Fas-ligand expressing plasmid"Transplantation. 66(11). 1416-1423 (1998)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yata Y, Enosawa S, Suzuki S, Li XL, Tamura A, Kimura H, Takahara T, Watanabe A: "In vivo Administration of Dichloromethylene Diphosphate (CL2MDP) to Obtain Highly Purified Hepatic Stellate Cells in Rats"Methods in Cell Science. (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Enosawa S et al.: "Higher efficiency of retrovirus transduction in the late stage of primary culture of hepatocytes from non-treated than from partially hepatectomized rat." Cell Transplantation. 7(4). 413-416 (1998)
• [文献書誌] Li XK et al.: "Prolonged survival of rat liver allografts transfected with Fas-ligand expressing plasmid." Transplantation. 66(11). 1416-1423 (1998)
• [文献書誌] Okuyama T et al.: "Fas-mediated apoptosis is involved in the elimination of gene-transducted hepatocytes with E1/E3-deleted adenoviral vectors." J Gastroent Hepatol. 13. 113-118 (1998)
• [文献書誌] Okuyama T et al.: "Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system." Gene Therapy. 5. 1047-1053 (1998)
• [文献書誌] Enosawa S et al.: "An attempt to add biological functions by genetic engineering in order to produce high-performance bioreactor cells for hybid artificial liver : Transfection of glutamine synthetase into chinese hamster ovary (CHO) cell." Cell Transplantation. 6. 537-540 (1997)
• [文献書誌] Enosawa S et al.: "Higher efficiency of retrovirus transduction in the late stage of primary culture of hepatocytes from non-treated than from partially hepatectomized rat." Cell Transplantation. (in press). (1998)
• [文献書誌] Suzuki S et al.: "The induction of lymphocyte apoptosis in MRL lpr/lpr mice treated with FTY720." Clin Exp Immunol. 107. 103-111 (1997)
• [文献書誌] Suzuki S et al.: "An immunosuppressive regimen using FTY720 combined with cyclosporine in kidney transplantation." Transplant Int. (in press). (1998)
• [文献書誌] Li X-K et al.: "FTY720,a novel immunosuppressive agent,enhances upregulation of the cell adhesion molecules ICAM-1 in TNF-a treated human umblical vein endothelial cells." Transplant Proc. 29. 1265-1266 (1997)
• [文献書誌] Li X-K et al.: "Induction of lymphocyte apoptosis by a novel immunosuppressant FTY720 : Relation with Fas,Bcl-2 and Bax expression." Transplant Proc. 29. 1267-1268 (1997)
• [文献書誌] Okuyama T et al.: "J Gastroent Hepat" Fas-mediated apoptosis is involved in the elimination of gene-transducted hepatocytes with E1/E3-deleted adenoviral vectors.(in press), (1998)
• [文献書誌] Okuyama T et al.: "Human Gene Therapy" Effeicient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.(in press), (1998)