| 研究概要 |
う蝕の原因菌であるStreptococcus mutansの病原性について,遺伝子工学的なアプローチが続けられてきているが,多くの遺伝子工学的手法は大腸菌において開発され,発展してきたためグラム陽性菌であるS.mutansにおける遺伝子工学的手法は,大腸菌のそれほど開発されておらず研究を進める上での問題点は多い.そこで本研究では,S.mutansで機能する各種の抗生物質耐性マーカーをクローニングし,一部についてはそのDNAシークエンスを決定した.次にそのシークエンスを元により短く,より使いやすい,マーカーシステムとなるようにPCRなどを用いて改良を加え,変異株の作製システムの最適化を試みた.
エリスロマイシン耐性遺伝子(erm)をもつ大腸菌-レンサ球菌シャトルベクターpVA838よりermを含む約1.6kbのDNA断片をクローニングし,このerm遺伝子の約800bpのオープンリーディングフレームの塩基配列を決定した.ついでトランスポゾンTn1545よりカナマイシン耐性遺伝子(aphA)をクローニングしその約1000bpのオープンリーディングフレームのDNA塩基配列を決定した.さらにTn1545由来のテトラサイクリン耐性遺伝子をクローニングし,最終的に,約2.7kbのカセットを得た.さらに頻用されるermとaphAについてPCR法を用いて機能する最小の長さの遺伝子のみを増幅し,同時に遺伝子の両端に遺伝子操作に便利なように制限酵素の切断部位を付加して,抗生物質耐性カセットを作製した.
一方変異株作製の別のアプローチとしてrandamly mutagenesisを試みた.ベクターpVA891を用いてS.mutansの染色体ライブラリーを作製し,S.mutansに形質転換して,相同組換えによって無作為に変異株を誘導した.これらの変異株のGTaseの局在をウエスタンブロットを用いて調べ,GTaseの機能領域に関わる遺伝子を探求したが,GTaseの局在に変化が生じているような有効な変異株を得ることができなかった。
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