| 研究課題/領域番号 |
09680589
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
原 三郎 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (00028193)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
1998年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1997年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | キチナーゼ / イネゲノム / クローニング |
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| 研究概要 |
米ヌカより単離・精製したキチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列に基づき、BamHI切断部位を末端に持つN末端側およびC末端側のプライマーを合成した。イネ子葉からゲノムDNAを抽出し、合成したプライマーを用いてPCR法によりキチナーゼ9KのcDNAを増幅した。得られたキチナーゼRS-9K DNAを配列分析用のベクターにサブクローニングし、DNA Sequencerにて塩基配列を分析して、キチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列と相同な塩基配列を持つベクターを選別した。このベクターを導入して形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドDNAを抽出後、制限酵素BamHIによってBamHI-9K DNAを切り出した。得られたキチナーゼDNAはトランスファーベクターpAcGP67aにライゲーションした。これをヨトウガ細胞に感染するウイルスDNAとco-transfectionすることにより、組み換えウイルスを作成した。しかし、この系によるタンパク質の発現は認められなかった。次に大腸菌発現系を用いるために、キチナーゼDNAをpET vector,pMAL vectorにそれぞれライゲーションし、発現条件で発現を試みた。しかし、キチナーゼの発現は認められなかったため、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)とのフュージョンタンパク質として大腸菌で発現する系を採用した。発現したタンパク質はグルタチオンカラムにより、1ステップで単離・精製された。発現タンパク質は、SDS-PAGEにより、フュージョンタンパク質であることが確認された。精製したGST-9Kフュージョンタンパク質はPreScission^<TM>ProteaseによりGSTとキチナーゼ9Kを切断し、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィーを用いることに精製した。しかし、精製リコンビナントキチナーゼ9Kにはキチナーゼ活性はなく、現在、発現タンパク質を活性型で発現する、酵母(Pichia)による発現系による発現を試みている。
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