| 研究概要 |
1. PhoB蛋白質のDNA結合性C末側断片について,大量生産系からの精製法として,(1)プロタミン硫酸による核酸除去,(2)ヘパリンカラムでの塩濃度勾配による溶出,(3)陽イオン交換カラムでのpH勾配による溶出,の3段階からなる改良法を開発し,SDS-PAGE,銀染色で単一バンドを与える程度の純度を持った標品を得た.これを用いて従来と同様の条件で単結晶を作製したが,その成長は約3倍速かった.得られた結晶はK_2PtCl_4に浸けて重原子置換体を作製しX線回折データを収集した.
2. PhoB蛋白質全体の大量発現系では,おそらく蛋白質発現細胞の消失によると思われる発現誘導の失敗が多かったので,(1)リーキーな発現株の選択使用,もしくは,(2)固体培地による前培養とよりstringentな抗生物質の使用,のいずれかの対策により最高10mg/L培養液の蛋白質が得られるようにした.
3. PhoB蛋白質全体について,(1)プロタミン硫酸による核酸除去,(2)陰イオン交換カラムでの塩濃度勾配による溶出,(3)ヘパリンカラムでの塩濃度勾配による溶出,(4)陽イオン交換カラムでのpH勾配による溶出,の4段階からなる精製法を開発し,SDS-PAGE,CBB染色で単一バンドを与える純度を持った蛋白質標品を得た.
4. 微量透析法および微量シッティングドロップ法により,PhoB蛋白質全体の結晶化条件の探索を行った.ここでは蛋白質試料が少量であったため特に後者の方法が有用であった.有望なものとして,硫安を沈澱剤として再現性よく微結晶様の沈澱を生ずる条件が見いだされたが,それ以上の顕著な結果は得られていない.また,アセチルリン酸によるリン酸化条件下でも結晶化も試み,spherulite様の沈殿物を与える条件を見いだした.
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