| 研究概要 |
昨年度は,アフリカツメガエルTFIIEαの発現構築体は成功しているが,βサブユニットの発現体の構築が困難のため,ヒトTFIIEα抗体がアフリカツメガエルのそれを認識することを確証後,主としてヒトTFIIEα及びβタンパク質並びに抗体を用いて研究を進めた。
(1) ヒトTFIIE抗体によるアフリカツメガエル卵母細胞抽出液に対するウエスタンブロッティング
アフリカツメガエル卵母細胞抽出液を電気泳動し,ブロッティング後,ヒトTFIIEα及びβ抗体が内在性TFIIEを認識するかどうか検討した。元来,アミノ酸配列の相同性において両者は80〜85%の相同性があったが,きちんと認識することを確認した。
(2) 非転写性プラスミドの紫外線損傷に対するアフリカツメガエル卵母細胞核抽出液を用いたTFIIEα並びにβ抗体のDNA修復
アフリカツメガエル卵母細胞核抽出液を既報(Oda,et al.J.Biol.Chem,1996)に従い,調製した。紫外線損傷プラスミドDNAはpSP65 plasmidを用い,〜5random CPD/plasmidとなるよう紫外線照射後,CsCl濃度勾配の超遠心で,cccDNAを精製した。これら卵母細胞核抽出液とDNAを用いて,既報(Oda,et al.Science,1996)に従い,紫外線損傷DNAの修復アッセイを行った。その結果,ヒトTFIIEα及びβ抗体ともDNAの修復を阻害した。しかしながら,これら抗体は,卵母細胞核抽出液を用いた一本鎖から二本鎖のDNA複製にはなんら阻害を示さなかったことから,ヒトTFIIEα及びβ抗体は,卵母細胞のDNA反応に対する一般的な阻害剤として働くのではなく,pSP65 plasmidの紫外線損傷DNAに対するDNA修復に特異的に働いていると考えられる。これらヒトTFIIEα抗体で阻害されたDNA修復が,外来性のヒトTFIIEα蛋白質で回復するかどうか調べたところ,阻害が回復した。そのためpSP65 plasmidのDNA修復にTFIIEが関与していると考えられる。
(3) 転写性プラスミドの紫外線損傷に対するアフリカツメガエル卵母細胞核抽出液を用いたTFIIEα並びにβ抗体のDNA修復の阻害効果
TFIIEは本来転写因子であるため,その転写活性との関連を調べるため,プロモーター含有プラスミドを大量調整した。pSP65-CMV-CATを用いたが,興味深いことにそれらのDNA修復に対してはヒトTFIIEα及びβ抗休は阻害しなかった。現在,この現象の意味について考察中である。
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