放線菌の生産するテルペノイドの生合成遺伝子のクローニングと解析

• 研究課題/領域番号: 09760114
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物生産化学・応用有機化学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 葛山 智久 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (30280952)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 1998年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 1997年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
• キーワード: biosynthesis / terpenoid / mevalonate pathway / HMG-CoA reductase / Streptomyces / nonmevalonate pathway / mevalonate

研究概要

1. 平成9年度 放線菌からメバロン酸経路の律速段階の酵素であるヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼの精製を行い、真正細菌から世界で初めてその遺伝子のクローニングに成功した。この酵素を大腸菌内で大量に発現させ、その性質を詳細に解析したところ、酵素学的性質に関しては真核生物由来の酵素と良く似ていたが、アミノ酸配列において真正細菌に特異的な配列があることを見いだした。
2. 平成10年度 非メバロン酸経路における1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸(DXP)から2-Cメチル-D-エリスリトール4-リン酸(MEP)に至る反応機構を解明するため、大腸菌よりMEPの合成に関与する酵素の遺伝子のクローニングを行った。そこでまず、MEP合成欠損変異株をスクリーニングするために必要なMEを化学合成した。次に、ランダムに変異を導入した大腸菌から、ME添加時のみ最少培地で生育できる株を選択した。約2万株をスクリーニングした結果、10株のME要求株を得た。次いで、大腸菌のゲノムライブラリーから、この変異を相補するDNA断片を取得し塩基配列を決定したところ、これらのいずれのDNA断片も大腸菌ゲノムの4.2minに位置するyaeM遺伝子を共通して含んでいた。次に、この遺伝子産物の機能を明らかにするため、この遺伝子の大量発現を行った。得られたタンパク質をMn^<2+>とNADPHの存在下、DXPと反応させ、反応生成物を精製した。その精製物のNMRとMSスペクトルを解析したところ、反応生成物はMEPであることが判明した。この結果から、このyaeM遺伝子産物は、DXPの骨格の分子内転位と同時に還元反応をも触媒し、一段階でDXPからMEPを合成するDXPレダクトイソメラーゼであることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] T.Kuzuyama,S.Takahashi,H.Watanabe,H.Seto: "Direct formation of 2-C-methy-D-erythritol 4-phoshate from 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,a new enzyme in the non-mevalonate pathway to isopentenyl diphosphate." Tetrahedron Lett.39. 4509-4512 (1998)
• [文献書誌] N.Orihara,T.Kuzuyama,S.Takahashi,K.Furihata and H.Seto: "Studies on the biosynthesis of terpenoid compounds produced by actiromycetes 3.Biosynthesis of the isoprenoid side chain of novobiocin via the non-mevalonate pathway in Streptomyces niveus." J.Antibiotics. 51. 676-678 (1998)
• [文献書誌] S.Takahashi,T.Kuzuyama,H.Watanabe and H.Seto: "A novel 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4-phoshate in an alternative non-mevalonate pathway for terpenoid biosynthesis." Proc.Natl.Acad.U.S.A.95. 9879-9884 (1998)
• [文献書誌] T.Kuzuyama,T.Shimizu,S.Takahashi and H.Seto: "Fosmidomycin.a specific inhibitor of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in the nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis." Tetrahedron Lett.39. 7913-7916 (1998)
• [文献書誌] S.Takahashi,T.Kuzuyama and H.Seto: "Purification,characterization,and cloning of a eubacterial 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,a key enzyme involved in the biosynthesis of terpenoids." J.Bacteriol.in press. (1999)
• [文献書誌] T.Kuzuyama,S.Takahashi,and H.Seto: "Construction and characterization of Escherichia coli disruptants defective in the yaeM gene." Biosci.Biotechnol.Biochem.in press. (1999)