| 研究概要 |
酵母2-Hybrid法はclonetech社のmatchmaker systemを使用した。GAL4DNA結合ドメインを有するpGBT9プラスミドにAuthentic ETS1およびETS1 Mutant(O-15)cDNA全長(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,4442-4446,1995,Suzuki et al.)をそれぞれPCRを用いてサブクローニングしGAL4 DNA結合ドメインとETS1あるいはETS1 Mutantとの融合蛋白質がコードされるBait Plasmidを作製した。この際Sequencingでフレームが合っているとを確認した。これらのBaitプラスミドを用いて既にGAL4結合配列-lacZレポーター遺伝子を組み込んである出芽酵母(Y-190)をトランスフォームしレポーター遺伝子産物をIPTGおよびX-GALを使って検出した。その結果ETS1 Mutantは予想どうりAuthenticなETS1に比べてトランスアクチベーション活性は低かったのでETS1 Mutant-pGBT9プラスミドをトランスフェクトした酵母を以下実験に用いた。pGAD10プラスミドを使ったヒト脳cDNAライブラリーおよびヒト悪性リンパ腫のcDNAライブラリー(Clonetech社)をそれぞれこの酵母に更にトランスフェクトし2-ハイブリッド法で陽性コロニーを選び出した。陽性コロニーは38ケ認め、更にスクリーニングを繰り返し最終的に31ケのコロニーを得た。陽性コロニーからpGAD10-cDNAを精製単離した。これらのプラスミドDNAを常法でSequencingしcDNAの塩基配列を調べ遺伝子Bankの既知の配列と比較検討した。既知の遺伝子でフレームの異なるクローンや逆向きのクローン、あるいは停止コドンがはやい位置に出現するクローンなどをのぞき最終的に2ケのクローンを得た。これらをClone15およびClone31としてさらに解析を続けている。
|
