| 研究概要 |
昨年度の研究によりクローニングしたPseudomonas aeruginosaのppk遺伝子の欠損株を作製したところ、病原性に関係の深いalginateの生産が低下していることが明らかになった。従って、P.aeruginosaにおいても、その病原性にポリリン酸が関与していることが明らかになった。この結果を踏まえて、P.aeruginosaのポリリン酸代謝をより明確にするために、新たに発見したポリリン酸分解酵素遺伝子の解析を行った。
ppkの下流須域(約2.0kb)の塩基配列を決定したところ、exopolyphosphatase(エンドタイプのポリリン酸分解酵素)をコードする大腸菌のppxと高いホモロジーをもつオープンリーディングフレーム(ORF1)が発見された。ORF1はppkとは逆向きに存在しており、その3'末端はppkの3'末端と14bp重なっていた。大腸菌において、ppkとppxはオペロンを形成しており,同一の転写ユニットにより支配されているが、P.aeruginosaでは異なったmRNAに転写され、お互いのmRNAがアンチセンスRNAとして働いている可能性が考えられる。
ORF1領域を発現ベクターにクローニングし、大腸菌での高発現系を構築した。ORF1を発現した大腸菌のcrude extractをSDS-PAGEにより分析したところ、約55kDaのタンパク質が過剰発現していることが分かった。このタンパク質の分子量は、ORF1のアミノ酸配列から予想される分子量(56,419Da)とほぼ一致していた。また,このcrude extractのexopolyphosphatase活性はORF1を発現していない大腸菌のextractの約30倍であった。上記の結果から、ORF1はP.aeruginosaのexopolyphosphatase(paPPX)をコードすることがわかった。
大腸菌内で高発現したPaPPXを各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。また、ゲル濾過クロマトグラフィーによりその活性画分の分子量をもとめたところ、約60kDaに相当する部分に活性が見られ、paPPXがモノマーで活性を持つことがわかった。
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