β-lactoglobulin抗原に対するミルクアレルギー患者T細胞応答の解析

• 研究課題/領域番号: 09770539
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 小児科学
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 伊上 良輔 岐阜大学, 医学部・附属病院, 助手 (60273132)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 1998年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 1997年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
• キーワード: ミルクアレルギー / 抗原 / β-lactoglobulin / T細胞 / HLA / クラスII / エピトープ / β-lactoglibolin

研究概要

1) β-lactoglobilin ペプチドの合成:β-lactoglobilinのアミノ酸配列に従い、オーバーラッピングペプチドを合成した.合成は,Fmoc-strategyに基づきシステムPSSM-8(Shimazu)によって施行した。
2) HLAタイピング:HLAクラスII(DR,DO,DP)対立遺伝子のタイピングは第11回International Histocompatibility Workshopにおいて施行された方法に基づき.PCR.SSOP法によって行った.
3) 抗原特異的T細胞株の樹立: ミルクアレルギー患者より末梢血単咳球(PBMC)を分離しβ-lactoglobilin坑原と共にこ96穴プレートて培養した.β-lactoglobilinペプチド混合物でパルスした自己のPBMCをfeederとしてrhIL-2(50U/ml)とrhIL-4(10U/ml)を7日毎に加え4株のβ-lactoglobilin 特異的T細胞株を得た.抗原特異的T細砲株からTerasakiプレートを用いた限界希釈法によりクローン化を行いβ-lactoglobilin特異的T細胞クローンCY2.7とSM4.6を樹立した.
4) 抗原特異的T細胞により認識されるT細胞エピトーブの解析: T細胞の抗原特異的増殖反応は培養72時問後の[^3H]TdRの取り込みにより定★した.β-lactoglobilin 特異的T細胞株に関して合計7つペプチド上にT細胞エピトーブが認められたが,各細胞株が認識認するエピトーブはそれぞれ異なるパターンを示した.IR line はp142-162のみ、AH lineは p14-29,p47-67,p77-97,p97-117を,TK lineはp1-21,p47-67を,MT lineはp1-21,p30-47,p97-117を認識していた.このうちp1-21,p47-67,p97-117の3つのペプチドは異なるタイプのHLAクラスH分子に拘束された複数のT細胞によって認識された.T細胞クローンIR1.9はp142-162を認識していた.MT2.9はp97-117を認識し,このうちp101-115が抗原決定基と考えられた.
5) 抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を用いた抗原提示分子の検討: 抗原特異的T細胞株およびクローンの抗原堤示分子を同定するために,抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べた.T細胞株では4株のうち3株で抗DR抗体により著明な増殖阻止反応が認められ,1株では抗DQ抗体によって増殖の阻止が認められた.T細胞クローンでは2クローン共に抗DR抗体により増殖阻止が認められた.β-lactoglobilin の抗原提示にはDR分子の関与が強く示された.
6) T細胞受容体の遺伝子解析: 樹立した抗原特異的T細胞のRNAからcDNAを合成し、RT-PCR法によりT細胞受容体(Vα,Vβ,Jα,Jβ)の解析を行った.ペプチド142-162を認織するIR1.9はVα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4を,ペプチド97-117を認識するMT2.9はVα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7を有していた.
7) T細胞によるサイトカイン産生の検討: IR line,AH line,MT lineに関してELISA法によりサイトカイン(IL-4,IL-5,IFN-γ)産生の検討を行った.3株共に大量のIL-5を産生していた.臨床的に即時型の症状を呈したAH line はIL-4の産生が優位であり,非即時型の症状を呈したIR lineはIFN-γの産生が優位であった.

研究成果

• [文献書誌] Ryosuke Inoue,et al.: "Severc complications of folk remedies for atopic dermatitis" Pediatric Asthma,Allergy & Immun ology. 12・3. 207-212 (1998)
• [文献書誌] Toshiyuki Fukao, Ryosuke Inoue,et al.: "Ataxia-telangiectasia in the Japanese population : Identification of R1917X,W2491R,R2909G,IVS33+2T→A,and 7883dc15,the latter two being relatively common mutations" Human mutation. 12. 338-343 (1998)
• [文献書誌] Hideaki Tashita, Ryosuke Inoue,et al.: "Molecular basis of selective IgG2 deficiency." J.Clin.Invest.101. 677-681 (1998)
• [文献書誌] Yukiji Yamada, Ryosuke Inoue,et al.: "Ataxia telangiectasia associated with B-cell lymphoma : the effect of half-dose of the drugs administered according to the acute lymphoblastic leukemia standard risk protocol" Pediatr Hematol Oncol.15. 425-429 (1998)
• [文献書誌] T.Teramoto, R.Inoue,et al.: "Serum IgE level is negatively correlated with the ability of peripheral mononuclear cells to produce interferon gamma (IFN-γ) : evidence of reduced expression of IFN-γ mRNA in atopic patients" Clin Exp allergy. 28. 74-82 (1998)
• [文献書誌] N.Kondo, R.Inoue,et al.: "DNasc I hypersensitive sites in human I_E region of immunoglobulin heavy chain genes abnormally induced by interleukin-4 in B-lymphocytes of atopic patients with high levels of serum IgE" Invest Allergol Clin Immunol. 8. 234-238 (1998)
• [文献書誌] Naomi Kondo, Ryosuke Inoue, et al.: "Iligh sensitivity and specificity of proliferative responses of lymphocytes to food antigens for detection of the offending food in patients with food-sensitive atopic dermatitis." Pediatric Asthma, Allergy, & Immunology. 10(4). 175-180 (1996)
• [文献書誌] Ryosuke Inoue, et al.: "Identification of Dermatophagoides farinae-2-derived peptides and class II HLA molecules recognized by T cells from atopic individuals." International Archives of Allergy and Immunology. 114. 354-360 (1997)
• [文献書誌] H.Kaneko, R.Inoue, et al.: "Two Japanese siblings with Bloom syndrome gene mutation and B cell lymphoma." Leukemia and Lymphoma. 27. 539-542 (1997)
• [文献書誌] Naomi Kondo, Ryosuke Inoue, et al.: "Inhibition of interferon-γ production from lymphocytes stimulated with food antigens by a β_2-agonist,procaterol,in patients with food-sensitive atopic dermatitis." Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 7(4). 225-228 (1997)
• [文献書誌] Hideo Kaneko, Ryosuke Inoue, et al.: "Management of malignant lymphoma in two siblings with Bloom's syndrome." Oncology Reports. 4. 1281-1283 (1997)