| 研究概要 |
1. 抗原(Cr依存性ATPasc)蛋白の精製と抗体作製
ラット脳由来の520kDaの精製Cl^--ATPase蛋白を家兎に免疫して、抗Cl^--ATpase抗体を作製した。この抗体は、脳および腎由来のEDTA処理形質膜両分のCl^--ATPaseを阻害し、精製Cl^--ATPaseのSDS-PAGE,Western blotting後、51kDa蛋白を認識した。
2. 免疫組織化学
この抗Cl^--ATpase抗体を用いて、ラット腎組織切片上でのCl^--ATPase蛋白の局在を、尿細管基底細胞膜に局在するNa^+,K^+-ATPaseと集合管主細胞管腔側に局在するAquaporin(AOP2)と比較して観察した。その結果、Cl^--ATPase蛋白は、腎皮質の遠位迂曲部尿細管と結合管および皮質と髄質の集合管の間在細胞の基底膜側細胞膜に局在することがわかった。
3. ラット腎Cl^--ATPase活性の検出
ラット脳Cl^--ATPase活性の検出法を用いて、5mMウアバイン・2mMアジ化ナトリウム存在下に、腎Cl^--ATPaseの性質を調べた。その結果、腎Cl^--ATPase活性は、脳Cl^--ATPaseと同様に、エタクリン酸により濃度依存的に阻害され、0.3mMでほぼ完全に阻害されることを確認した。また、そのCl^--ATPase活性は、Cl^-濃度がおよそ30mMで最大値に達した。
4. ヒト腎Cl^--ATPase活性の検出
摘出腎癌の健常皮質部および髄質外層部から作製した酵素標品のCl^--ATPase活性を測定した。その結果、皮質部で3.0および髄質部では2.2(μM Pi/mg protein/hr)の活性が認められた。
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