| 研究課題/領域番号 |
09771942
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
水谷 隆太 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1998年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1997年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | プロトザイム / プロテインスプライシング / エンドヌクレアーゼ / インテイン / X線結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
酵母VMAl遺伝子がコードする一本鎖蛋白質は、液胞性ATPase触媒サブユニットを切り出し、中央部のDNAエンドヌクレアーゼ(Vmal derived endonuclease、以下VDE)を生成する。ポリペプチド鎖の切り出しと接続によるこの現象は、プロテインスプライシングと呼ばれており、自己触媒的に進行する。スプライシング反応の機構を三次元構造に基づいて明らかにすることを目的として、両端にスプライシングペプチド部分を付加したVDE(XA-VDE)のX線結晶構造解析を行った。大腸菌発現系によりXA-VDEを調製し、結晶化した。2人分解能までのX線回折強度データ(completeness97%)を測定し、分子置換法により得た初期モデルを結晶学的に精密化した。10〜2Å分解能においてR因子が0.203(R_<free>は0.264)まで精密化した。
XA-VDE結晶は野生型VDEの構造と同型であり、スプライシング活性を有するドメインIについては、そのrmsdが0.35人、エンドヌクレアーゼ活性に重要なドメインIIでは0.62人であった。N末端には付加したペプチド鎖に相当する電子密度が観察された。スプライシング反応に必須なHis362の側鎖が、切断されるペプチド結合の近傍に存在し、その反対側には変異を導入したAla284側鎖が位置している。C末端側4残基については相当する電子密度が得られず、MALDI-TOF質量分析によっても、Ala738以下を欠落していることを確認した。これは、スプライシング反応のステップでもあるAsn737の後での切断反応が進行した結果である。
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