植物リポキシゲナーゼの活性の翻訳後調節機構の探索

• 研究課題/領域番号: 09876095
• 研究種目: 萌芽的研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用分子細胞生物学
• 研究機関: 島根大学
• 研究代表者: 長屋 敦 島根大学, 生物資源科学部, 助教授 (50284021)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1999
• 研究課題ステータス: 完了 (1999年度)
• 配分額: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円); 1999年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 1998年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 1997年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
• キーワード: リポキシゲナーゼ / 遺伝子工学 / キメラタンパク質 / malE / 創傷応答 / 植物 / 活性調節 / アフィニティー / mal E / 抗血清 / キメラ蛋白質 / 翻訳後修飾

研究概要

タイズのリポキシゲナーゼ(Lox)のβ-バレル構造を特徴としたN末端ドメイン部分は、リパーゼとも共通の構造モチーフであることが最近報告されつつある。そして、リパーゼではこのモチーフ部分がコリパーゼと呼ばれる別の調節タンパク質と相互作用する部分である。そこでLoxにおいてもこのコリパーゼに相当する調節タンパク質の存在を探索している。
今年度は、ダイズLoxの二つのアイソザイムL1とL2のN末端ドメイン部分約140アミノ酸をmalEタンパク質との融合タンパク質として大腸菌で大量発現させた。この融合タンパク質と抗malE血清を用いてウェストウェスタン法及びアフィニティーカラムによる共精製法によりLoxのN末端ドメインと結合するタンパク質をダイズ種子抽出物中より探索してみている。
すなわち、ダイズ種子を粉砕、脱脂後、PBSによりタンパク質を抽出、SDS-PAGEによる分離後、PVDF膜へ転写し、今回の融合タンパク質、抗malEウサギ血清、ペルオキシダーゼラベル抗ウサギIgGの順に反応させ、発色させた。しかし、現在の所はっきりしたバンドの検出には至っていない。また、今回の融合タンパク質はmalE部分でアミロースレジンに対してアフィニティーを持っているので、これを利用し、ダイズ種子抽出液と融合タンパク質を混合後アミロースレジンにより融合タンパク質を精製し、共精製されてくるタンパク質を見てみた。しかし、こちらの試みでも有力な候補タンパク質は捕えられていない。今後は、使用するLoxのN末ドメイン部分をさらに長くする、混合時の条件を変えてみるなどしてさらに検討を続ける予定である。