| 研究概要 |
大腸菌発現ベクターとしてpax-5ベクターを用いた.全長c-DNAを制限酵素のNco1とSma1で切断しcoding領域をクローニングした.次に,このプラスミドをHB101コンピータント細胞にトランスフェクションし,適当なコロニーを使いIPTGによる発現実研をおこなったが,成功しなかった.その理由としては,当該タンパクのN末端の10-15残基が大腸菌に毒性に働くためと思われた.そこで,coding領域の末端にHisタグを接続し酵母ベクターPyex-sにクローニングしたが発現量が極端に低いため発現実研を断念せざるをえなかった.現在,当該タンパクのN末端の10-15残碁を削り大腸菌発現ベクターPet-16にクローニングし発現実研行っているがまだ結論を得られていない.
しかしながら,最近のpetシステムの解説書をみると,pet 16シリーズに関して重大な変更がみられる.
pet 16には,ペニシリン耐性遺伝子が組み込まれているが,この蛋白質に翻訳されると細胞内に留まらず培養液中に放出されるためアンピシリンを分解し,プラスミドを持たない大腸菌が主に生育してしまうと報告している.したがって,アンピシリンの代わりにカルベニシリンを大量に使用するように指示されている.
この方法を用いれば,ある程度の量まで大腸薗を増殖させた後にIPTGを添加すれば,理論的にはたとえ蛋白質が毒性を有していても発現は可能なはずである.
現在,このプロトコールにしたがって発現を行っているが,全長蛋白でさえ,その発現がSDS-PAGEで確認されている.シークエンスを行っていないので結論的には言えないが今後確認するつもりである.
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