新たに見出した1価陽イオンポンプ触媒鎖N末端の多重リン酸化の意義解明の糸口

• 研究課題/領域番号: 09878131
• 研究種目: 萌芽的研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 谷口 和弥 北海道大学, 大学院理学研究科, 教授 (40028204)
• 研究分担者: 島田 明 北海道大学, 大学院理学研究科, 講師 (60001848) ; 今川 敏明 北海道大学, 大学院理学研究科, 助教授 (20142177) ; 嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院理学研究科, 助教授 (90186023)
• 研究期間 (年度): 1997 – 1998
• 研究課題ステータス: 完了 (1998年度)
• 配分額: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 1998年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 1997年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: Naポンプ / Hポンプ / リン酸化 / フォスファターゼ / キナーゼ / オリゴマー / H^+,K-ATPase / チロシンキナーゼ / セリンキナーゼ / カルシウム / Na / K-ATPase

研究概要

H/K-ATPaseの末端の多重リン酸化に関して,関与するTyr-KinaseとSer-Kinaseを免疫化学的手法で同定することに成功し又Tyr-phosphataseに関して新たな酵素で有る可能性が示唆された。さらに従来のin vitroで検出されていた、可逆的リン酸化が胃壁細胞で生じていることが明かにされた。多重リン酸化とP-typeATPasesのoligomer構造との関係を明かにするため膜Na/K-ATPase及びH/K-ATPaseの機能的単位が_-protomerを単位とするoligomer構造からなることを直接証明するための研究をおこなった。その結果、触媒鎖あたりのRbの結合はRb閉塞酵素、Mg,Naと低濃度ATPに依存するRb閉塞、Mg,Naと高濃度ATP存在下でのRb閉塞でそれぞれ2:1:0.5となった。ATPの最大結合量は高濃度のEDTA存在下で触媒鎖あたり0.75、ATPase反応中には、0.25に低下した。さらに興味深いことはATPase反応中の1/2の触媒鎖がリン酸化中間体を形成しているさい、1/4の触媒鎖にはATPが、他の1/4の触媒鎖にはADPとPiのいずれも酸に不安定な形で結合していることがはじめて明かにされたことである。これらの結果は、Na/K-ATPaseが4量体構造をとり、P-type ATPaseに共通の反応中間体EPと同時に筋収縮に関与するMyosin,ATPaseと類似の反応中間体E-ADP-Piを形成することを初めて示したものである。

研究成果

• [文献書誌] T.Tsuda: "Fluorescein 5'-Isothiocyanate-Modified Na, K-ATPase at Lys-501 of the α-Chain, Accepts ATP Independent of Pyridoxal 5'-Diphospho-5'Adenosine Modification at Lys-480." J.Biochem.vol.123. 169-174 (1998)
• [文献書誌] T.Imagawa: "Does Binding of Ouabain to Human α1 Subunit of Na,K-ATPase Affect the ATPase Activity of Adjacent Rat α1 Subunit?" Jpn.J.Pharmacal.vol.76. 415-423 (1998)
• [文献書誌] T.Tsuda: "Half-site Modification of Lys-480 of the Na,K-ATPase α-Chain with Pyridoxal 5'-Diphospho-5'-adenosine Reduces ATP-dependent Phosphorylation Stoichiometry from Half to a Quarter" J.Biol.Chem.vol.273. 24334-24338 (1998)
• [文献書誌] T.Tsuda: "ATP and Acetry Phosphate Induce Molecular Events near the ATP binding Site and the Membrane Domain of Na,K-ATPase." J.Biol.Chem.vol.273. 24339-24345 (1998)
• [文献書誌] D.J.Kane: "Stopped-Flow Kinetic Invegtigation of Conformational changes of Piy Kidney Na^+,K^+-ATPase." Biochemistry. Vol36,No43. 13406-13420 (1997)
• [文献書誌] T.TSUDA: "Are Phyidoxal and Fluoregcein Prabes in Lysine Regldues of α-chain in Na^+,K^+-ATPase Senging ATP Binding?" Ann.N.Y.Acad Sci.834. 186-193 (1997)
• [文献書誌] J.P.FROEHLICH: "Complex Kinetic Behavior in the Na,K-and Ca-ATPases" Ann.N.Y.Acad.Sci.834. 280-296 (1997)
• [文献書誌] K.TOGAWA: "Phosphorylation of Tyr^7,Tyr^<10>,and Ser^<27> of α-chain in Na^+,K^+-ATPase by Intrinsic and Extrinsic Kinases" Ann.N.Y.Acid Sci.834. 582-584 (1997)
• [文献書誌] S.KAYA: "Cloning of the Eel Electroplax Na^+,K^+ATPase α Subunit" Ann.N.Y.Sci.834. 129-131 (1997)
• [文献書誌] H.Eguchi: "ATP-Induced pynamic Fluorescence changes of a N〔1-(2-Benzimidazolyl)pheny1〕maleimide probe at cys in the α-chain of Pig Stomach H^+,K^+ATPase" J.Biochem. 122. 659-665 (1997)
• [文献書誌] T.TSUDA: "Fluorescein 5′-Tsothiocyanate-Modified Na,K-ATPase,at Lys-501 of the α-Chain,Accepts ATP Independent of Pyridoxal 5′-Diphosphc-5′-Adenosine Modification at Lys-480" J.Biochem. 123. 169-174 (1998)