| 研究課題/領域番号 |
10129223
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
杉山 政則 広島大学, 医学部, 教授 (30106801)
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| 研究分担者 |
熊谷 孝則 広島大学, 医学部, 助手 (70274058)
大谷 和弘 広島大学, 医学部, 助教授 (20203820)
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| 研究期間 (年度) |
1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1998年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | X線結晶構造解析 / 金属錯体 / 抗生物質 / ブレオマイシン / ブレオマイシン結合蛋白質 / 大腸菌 / 蛋白質の結晶化 |
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| 研究概要 |
平成10年度は、Tn5由来のブレオマイシン(Bm)耐性遺伝子産物(BLMTと命名)の性質を調査するため、先ず、大腸菌のホスト・ベクター系を用いてBLMTの大量発現系を確立した。さらに、BLMTを精製し、本蛋白質がBmを特異的に認識し、Bmに結合する蛋白質であることを明らかにした。
一方、Tn5由来のBm耐性遺伝子bleを大腸菌に導入すると、非導入に比べ、宿主大腸菌が長く生存できる(survival advantageと命名)ことを見い出した。さらに、site-directed mutagenesis法を用いて、BLMTの7番目のProlineをLeucineに置換することで、Bm結合能を失わせた変異BLMTを作成した。この変異型BLMTを産生する大腸菌の生存能を調べた結果、野生型BLMTを産生する大腸菌と同等のsurvival advantageが付与された。この結果はBLMTのBm結合能とsurvival advantageを付与する能力は非依存的であることを示す。
次に、BLMTのX線結晶構造解析をするため、その結晶化を行い、予備的なX線結晶構造解析を試みた。その結果、本結晶は斜方晶系に属し、空間群C222_1、格子定数はa=81.56,b=85.25,c=78.91Åであった。回折強度データの収集をPhoton FactoryのBL18Bにて波長1.0Åで行った結果、1つの結晶から2.0Å分解能での完全なデータセットを収集できた。得られたデータセットのR_<merge>は0.052、完全性は90.6%であった。
BLMTの構造解析は分子置換法にて行った。その初期モデルをX-PLORを用い精密化を行った結果、2.0Å分解能での最終モデルは、水分子90個を含み、R=19.3%,R_<free>=25.8%となった。得られたBLMTの三次元構造は、主鎖のホールディングにおいて、BLMAとほぼ同じであった。
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