| 研究課題/領域番号 |
10163223
|
|---|
| 研究種目 |
特定領域研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
前田 正知 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (80190297)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1998
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
|
| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1998年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
|
|---|
| キーワード | GATA因子 / GATA6 / DNA結合蛋白質 / 転写制御因子 / Aキナーゼ / プロテアソーム / 変異株 |
|---|
| 研究概要 |
特異的蛋白の分解経路にかかわる因子を遺伝学的に解析することを目指し、ブラストサイジンデアミナーゼ遺伝子のプロモーターにGATA-6の結合配列を2個または8個直列につないだ発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドを導入したCHO-K1細胞では、GATA蛋白質依存的にプラストサイジンデアミナーゼを発現することが期待される。実際、GATA-6を発現させたCHO-K1細胞にこのプラスミドを導入すると、プラストサイジン抵抗性を獲得するがジブチリルCAMPを添加するとGATA-6が分解し、したがって抵抗性が消失した。このような細胞を用い、ジブチリルCAMPが存在しても生育できる変異細胞を分離し、細胞内分解経路(すなわちcAMPからプロテアソームにつながる経路)にかかわる因子を明らかにすることが可能になった。そこで、アルキル化剤による変異導入を行った結果、ブラストサイジンに抵抗性を示しジブチリルcAMPか存在しても生育できる変異細胞を複数分離することができた。これまでに6クローンを分離したが、それらの変異細胞の核抽出画分を用いて、ゲルシフト法およびウエスタンブロッティング法によってGATA-6がcAMP存在下に分解しないことを確認した。また、S100画分を調製しプロテアソームの活性を測定する系も確立できた。なを、GATA-6の分解はN末、C末、DNA結合に関わる中央部ともでおきていることが、抗体の反応性およびゲルシフト法により明らかにした。このような成果をもとに、変異部位の同定を行うことが可能になっている。
|
