| 研究概要 |
ColE2プラスミドDNA複製系では,プラスミドにコードされた必須複製開始蛋白(Rep)の発現が,そのmRNAに対するアンチセンスRNA(RNAI)により,翻訳の段階で調節されている.RNAIがRepmRNAと完全に二重鎖を形成した場合にも,開始コドンとその上流15ヌクレオチドを含む翻訳開始領域はRNAIに覆われないので,RNAIによるRep蛋白発現の阻害の機構は単純ではない.開始コドンの上流隣接領域にはSD配列が存在せず,Rep蛋白の発現には,翻訳開始領域から遠く離れた非翻訳領域内および翻訳領域内の2カ所の部位が必要である.mRNA上のこれらの部位が相互作用するか,あるいはこれらの部位とリボゾームなどが相互作用することがRep蛋白発現に必要であり,RNAIの結合がこのような相互作用を阻害している可能性がある.また,Rep蛋白の発現調節は,RNAIの結合によるRepRNAのダイナミックな構造変化を介して行われている可能性もある。本研究では,ColE2Rep蛋白発現の機構(翻訳開始の機構)とRNAIによる調節機構(翻訳開始の阻害の機構)の解明を目的として,RepRNAの翻訳効率やRNAIの調節機能に影響を及ぼすような新しい塩基置換変異の分離とその性質の解析などを行った。部位指定の塩基置換導入を試みても,予期せぬ挿入,欠失をもつものばかりで目的の変異をほとんど得ることができなかった。この領域が複雑な2次〜高次構造を形成するRNAをコードするためと考えられ,このようなDNA領域に簡便に塩基置換変異を導入する条件を確立することが重要であった。最近になり,この種のトラブルをほぼ解決でき,新たな変異体も得られはじめた。今後,部位指定の塩基置換の導入法の検討も行い,多くの変異体を集め,それらの性質を明らかにし,翻訳の開始に必要な上流,下流配列の実体を明らかにしたい。
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