| 研究課題/領域番号 |
10179205
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
田中 信夫 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (50032024)
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| 研究分担者 |
宮澤 恵二 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40209896)
喜多村 直実 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (80107424)
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| 研究期間 (年度) |
1998
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| 研究課題ステータス |
完了 (1998年度)
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| 配分額 *注記 |
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1998年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | 細胞増殖制御 / シグナル伝達 / 結晶構造 |
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| 研究概要 |
HrsはHGF刺激された細胞において速やかにチロシンリン酸化される775アミノ酸残基からなるタンパク質で、初期エンドソームの細胞質側表面に存在し、細胞質および膜画分から検出される。また、ノーザンブロット解析により、多くの臓器や細胞で発現することが明らかになっている。その一次構造からZnフィンガーの存在が示唆されるが、本研究では、HrsのZnフィンガードメインのPtdIns(3)P認識機構の解明を目的に、Znフィンガードメインの発現系構築、精製、結晶化および機能解析を行った。
Hrs全領域をGST融合タンパクとして発現させたが、大腸菌内で分解され精製が不可能なため、また、アミノ酸残基290からはプロリン残基が富む領域であることからそのN末端側である1-289残基の領域(HrsN)をGSTとの融合タンパク質として大腸菌BL21(DE3)によって発現させ、大腸菌より溶出後、グルタチオンセファロース4Bゲルで粗精製した後にトロンビンによりGSTとHrsNを切り離した。その後、ゲルろ過力ラムSuperdex200による脱塩、グルタチオンセファロース4BゲルによるGSTの除去、MonoQによるイオン交換クロマトグラフィー、Superdex200による脱塩を経て最終試料とした。SDS-PAGEおよびNative-PAGEによる純度測定の結果、CBB染色で単一バンドとして検出された。
結晶化条件の初期検索はCrystaI ScreenIとIIを用いてハンギングドロップ蒸気拡散法でおこなった。その結果、HrsN濃度3mg/ml、温度20℃の条件でいくつかの条件で顆粒状の微小結晶が得られたが、その大きさが極めて小さいものであった。今後、結晶化実験を続ける予定である。
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