| 研究課題/領域番号 |
10470022
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
薬理学一般
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
小浜 一弘 群馬大学, 医学部, 教授 (30101116)
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| 研究分担者 |
中村 彰男 群馬大学, 医学部, 助手 (30282388)
石川 良樹 群馬大学, 医学部, 助手 (20212863)
岡垣 壮 群馬大学, 医学部, 講師 (80185412)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
13,600千円 (直接経費: 13,600千円)
1999年度: 6,600千円 (直接経費: 6,600千円)
1998年度: 7,000千円 (直接経費: 7,000千円)
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| キーワード | ミオシン軽鎖キナーゼ / ミオシン / アクチン / 平滑筋 / リン酸化 / 細胞運動 / 遊走能 |
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| 研究概要 |
平滑筋は通常は収縮型細胞で構成されるが、血管病変では増殖型が現れる。アクトミオシン系は前者では収縮を起こすが、後者では細胞質分裂・遊走能を担っている。このアクトミオシン系に対し、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)は重要な制御蛋白質と考えられている。しかし、この考えはin vitroでのもので、in vivoでは問題が多い。
血管平滑筋由来のSM3株を母体とし、MLCK遺伝子発現を阻止した株(SM3・MLCK-)の樹立にどこよりも先に成功した。これを機に、MLCKに関連し、in vivoで以下の点に於いて解析する計画をたてた。I)SM3・MLCK-とそのコントロールの比較により、MLCK遺伝子発現の阻止によりどのような変化が起こるか?検討を加える。ii)MLCKのアクチン結合部の導入による機能回復はどの項目か?レスキュー実験により検討を加える。iii)MLCKのキナーゼ部位とミオシン結合部位をそれぞれ導入し、回復する機能はあるか?検討をする。iv)MLCK遺伝子発現阻止(ノックアウト)を、今度は、増殖を伴う血管病変モデル動物で試みる。
方法:MLCKをノックアウトしてSM3・MLCK-株とコントロール株をカバーグラス上に培養し、トリトンX100を含むフォルムアルデヒドで固定する。細い線維はローダミンでラベルされたフォロイジン(市販)を用いアクチン染色で、太い線維は平滑筋ミオシン重鎖抗体(現有)によるミオシン染色で検出する。検出には現有の蛍光顕微鏡を用いる。結果:まず運動性の細胞に特有なmembrane rufflingがSM3・MLCK-株では欠損している事をみつけたが、さらにプラスミドにMLCK・cDNAをセンス方向に組み込んだconstructを作成し、SM3・MLCK-株に導入し、レスキューを行った。これによりmembrane rufflingはSM3と同様に発生することが明らかとなった。展望:さらにレスキュー実験を発展させるため、アデノウイルスベクターにMLCK・cDNAをセンス方向に組み込んだ。現在感染力の高いconstructを得つつあるが、cDNAのどの部分がレスキューを行うか?検討したい。
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