| 研究概要 |
アルツハイマー病(AD)においては脳にアミロイドβ(Aβ)蛋白が沈着し特有の病変が引き起こされる。Aβの産生・沈着過程の背景にあるAPP細胞内処理過程の分子機構を明らかにするために、培養横紋筋細胞を用いて以下の検討を行った。
I)培養横紋筋細胞のおける各種薬剤のAPP処理過程に対する影響:横紋筋細胞株(CRL7061)にchloroquine、Monennsinn,brefeklin、concanamysinなどの蛋白輸送阻害剤を添加してAPP,PS-1の処理過程を検討した。
1)APP並びにPS-1の局在:阻害剤添加によって特有の空胞が出現する。蛍光抗体法的に観察すると、APP,PS-1の断片の一部は空胞に局在する。二重染色によってPSはGolgi装置に局在が示された。
2)APPならびにPS-1のmRNA測定:RT-PCRで半定量的に測定するとCQNの添加によって発現は亢進する。
3)APPの処理過程:ウエスタンブロット法によって細胞画分の断片を検討した。Amyloidogenicな10kDaの断片は増加した。メタボリックラベルによって4kDaのAβはCQN,ConA,BFNによっても減少するが確認される。PSは20,30,50kDaのバンドが認められた。以上の結果は、APPとPSは密接に関係しておりAβはエンドソーム・リソソームを中心に複数の経路で産生されることが示唆された。
II)各種APP遺伝子強制発現した培養菌細胞でのAPPの処理過程:野生型APPの他変異型APP遺伝子(British,Dutch,Swedish)の導入を試みたが、CRL7061では成功しないため導入の諸条件を検討した。アデノウイルス発現ベクター(pTarget-T)に組み替えを行い、培養ヒト筋細胞、CCL-135,CRL-7767にも導入を試みた。野生型APPでは成功したが、変異型APP遺伝子では細胞毒性が強いため現在遺伝子の導入における条件を検討中である。
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