電子伝達系とカップルする2原子酸素添加酵素のX線結晶構造解析と構造活性相関

• 研究課題/領域番号: 10490017
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 広領域
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 三井 幸雄 長岡技科大, 工学部, 教授 (40012637)
• 研究分担者: 政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 講師 (20272867) ; 千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• 研究期間 (年度): 1998 – 1999
• 研究課題ステータス: 完了 (2000年度)
• 配分額: 10,600千円 (直接経費: 10,600千円); 2000年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 1999年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 1998年度: 5,900千円 (直接経費: 5,900千円)
• キーワード: biphenyl dioyxgenase / ferredoxin reductase / X線結晶構造解析 / 蛋白結晶学 / 電子伝達機構 / 2原子酸素添加酵素 / 重原子同型置換法 / 吸収スペクトル / BphA / ジオキシゲナーゼ / 芳香環分解 / 立体構造解析 / 電子伝達系 / フェレドキシン還元酵素

研究概要

BphA4(ferredoxin reductase)の結晶構造の決定
BphA4-NADH複合体の立体構造を2.6Å分解能で決定した。この結果立体構造のみならずNADHの結合様式もGlutathione reductaseと類似していることが明らかになった。これらの立体構造から、BphA3(ferredoxin)の結合位置やBphA4内の電子伝達の経路に関して新たな知見が得られた(投稿準備中)。
BphA4の電子伝達機構に関する知見を得るため、無酸素条件を作り出せる吸光度測定用のセルを作成し、BphA4-NADH複合体の吸収スペクトルの測定を行った。この結果、BphA4は、酸素存在下では、2電子還元型としては安定に存在せず、急速に酸化して酸化型に戻ること、セミキノン型は安定には存在しないことを明らかにした。また、BphA4一分子に対して1分子のNADHが結合し、2電子還元型になることも明らかにした。この2電子還元型のスペクトルは、putidaredoxin reductaseの2電子還元型のものと酷似しており、1次構造から推定される立体構造の類似性を考えあわせると、両蛋白質は同一の機構で電子伝達反応を行うことが強く示唆された。
BphA1A2(biphenyl dioxygenase)の構造解析
BphA1A2は、PCB分解系中の初発酸化酵素であるBphAの活性部位を構成するコンポーネントで、α_3β_3のサブユニット構成を持っている(分子量約20万)。本年度は、Rhodococcus sp strain RHA1由来のBphA1A2の結晶化条件の最適化を行い、約3Åの回折点を与える結晶を得た(投稿準備中)。この結晶の空間群はP4_12_12で、格子定数は、a=b=139.9Å c=240.2Åであった。この結晶を用いて放射光実験施設(PF)において回折データの収集を行った。また、水銀の重原子同型置換体の作成にも成功している。このため、平成12年度には立体構造を決定できると考えている。

研究成果

• [文献書誌] Sugimoto K.: "Purification and crystallization of a protocatechuate 4,5-dioxygenase LigAB from Sphingomonas pausimobilis SYK-6"Protein and Peptide Lett.. 6. 55-58 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto K.: "Crystal structure of an aromatic-ring-opening dioxygenase LigAB, a protocatechuate 4,5-dioxygenase, in aerobic condition"Structure Fold Des.. 7. 953-965 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto K.: "Purification and Crystallization of a Catechol 2,3-Dioxygenase PheB from Bacillus stearothermophilus BR219"Protein and Peptide Lett.. 6. 403-406 (1999)
• [文献書誌] Ohtsubo Y.: "PcpA, which is involved in the degradation of pentachlorophenol in Sphingomonas chlorophenolica ATCC39723, is a novel type of ring-cleavage dioxygenase"FEBS Letters. 459. 395-398 (1999)
• [文献書誌] Matsumoto T.: "Three-dimensional structure of the catalytic domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 at a very high resolution"Proc. Acad. Japan. B75. 269-274 (1999)
• [文献書誌] Taguchi S.: "A cold-adapted protease engineered by experimental evolusion system"J. Biochem. (Tokyo). 126(4). 689-693 (1999)
• [文献書誌] Fujimoto K.: "Functionally important residues tyrosine-171 and serine-158 in sepiapterin reductase"Biochim. Biophys. Acta.. 1431(2). 306-314 (1999)
• [文献書誌] Peng X.: "Characterization of the meta-cleavage compound hydrolase gene involved in degradation of the lignin-related biphenyl structure by Sphingomonas paucimobilis SYK-6"Appl. Environ. Microbiol.. 65(6). 2789-2793 (1999)
• [文献書誌] Tanabe,T.,Tanaka,N.,Nonaka,T.,Mitsui,Y.,Yoshimoto,T.et al.: "Roles of the Ser146,Tyr159 and Lys163 n the catalytic action of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase." J.Biochem.(Tokyo). 124. 634-641 (1998)
• [文献書誌] Sugimoto,K.,Aoshima,H.,Senda,T.,Masai,E.,Fukuda,M.& Mitsui,Y: "Purification and crystallization of a protocatecuate 4,5-dioxygenase LigAB from Sphingomonas paucimobilis SYK-6." Protein and Peptide Letters. (in press). (1999)
• [文献書誌] Sugimoto,K.,Senda,T.,Aoshima,H.,Masai,E.,Fukuda,M.& Mitsui,Y.: "Crystal structure of an aromatic-ring-opening dioxygenase LigAB which is a protocatechuate 4,5-dioxygenase." Structure. (in press). (1999)
• [文献書誌] 三井幸雄、千田俊哉、野中孝昌: "「遺伝」 52巻,7号" X線で見る-生体高分子から生物マシーナリーへ-, 6 (1998)