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緑膿菌バイオフィルム感染症治療に対する細菌アルギン酸リアーゼの機能と安全性

研究課題

研究課題/領域番号 10556017
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分展開研究
研究分野 応用微生物学・応用生物化学
研究機関京都大学

研究代表者

村田 幸作  京都大学, 食糧科学研究所, 教授 (90142299)

研究分担者 橋本 渉  京都大学, 食糧科学研究所, 助教授 (30273519)
研究期間 (年度) 1998 – 2000
研究課題ステータス 完了 (2000年度)
配分額 *注記
8,700千円 (直接経費: 8,700千円)
2000年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
1999年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
1998年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
キーワードアルギン酸リアーゼ / バイオフィルム / バイオフィルム感染症 / 抗原性エピトープ / 酵素療法 / 部位特異的変異 / アルギン酸 / 緑膿菌感染症 / Shingomonas属細菌 / バイオフィルム細菌感染症 / 緑膿菌 / X線結晶構造解析 / 嚢胞性線維症 / 抗原性 / 細菌感染症 / ヘテロ多糖 / 緑濃菌
研究概要

緑膿菌感染症に代表される細菌感染症では、感染局所で細菌が高粘性・高分子量の多糖アルギン酸を合成分泌し、これをバイオフィルムとした棲息形態を取る。このバイオフィルムは強固であり、且つ物質透過制御機能を持つため通常の抗生物質投与による治療には限界がある。本研究では、新たな治療法として酵素アルギン酸リアーゼでバイオフィルムを溶解・除去する方法を提案し、酵素の安全性確保(抗原性除去)の検討を進めた。本酵素の抗原性エピトープ部位は、生化学的方法とアルギン酸リアーゼ(A1-III)の3次元構造に基づいて、酵素のN末端側27Ser〜44Cysに特定した。この部位は、酵素活性に必要な活性クレフトとは離れているため、抗原性エピトープの完全除去、或いは部位特異的変異による部分的構造変換が可能であると判断された。まず、部位特異的変異による抗原性除去を行うため、この部位における表面露出度の高い27Ser、29Gln,32Asp,及び40Lysについて、それぞれ非極性アミノ酸であるアラニン残基に置換したS27A、Q29A、D32A、及びK40A変異体を作製し、それらの大腸菌での大量発現を行った。その結果、K40Aは強固な封入体となったため、40Lysは酵素のフォールディングに重要であることが示唆された。S27A,Q29A、及びD32A変異体は、野生型と同等の酵素学的性質を示した。この3種類の変異アルギン酸リアーゼをマウスに投与し、その抗原性を評価している。このようにコンピューターモデリングとタンパク質工学により改変した酵素の抗原性を動物試験で評価することにより、人体に適用可能な完全無抗原性酵素を調製する基盤を確立した。また、酵素A1-IIIのアルギン酸溶解機構を明らかにするため、活性中心近傍の詳細な構造も明らかにした。

報告書

(4件)
  • 2000 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1999 実績報告書
  • 1998 実績報告書
  • 研究成果

    (33件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (33件)

  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Crystal structure of alginate lyase A1-III complexed with trisaccharide product at 2.0 Å resolution"Journal of Molecular Biology. (印刷中). (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Effect of His192 mutation on the activity of alginate lyase A1-III from Sphingomonas species A1"Journal of Microbiology and Biotechnology. (印刷中). (2001)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Takafumi Itoh: "Crystal structure of N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase from porcine kidney at 2.0 Å resolution"Journal of Molecular Biology. 303・5. 733-744 (2000)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Keiko Momma: "A novel bacterial ATP-binding cassette (ABC) transporter system that allows uptake of macromolecules"Journal of Bacteriology. 182・14. 3998-4004 (2000)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Molecular identification of oligoalginate lyase of Sphingomonas sp.strain A1 as one of the enzymes required for complete depolymerization of alginate"Journal of Bacteriology. 182・16. 4572-4577 (2000)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Overexpression in Escherichia coli, purification, and characterization of Sphingomonas sp.A1 alginate lyases"Protein Expression and Purification. 19・1. 84-90 (2000)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Biopolymers.Volume 7: Polysaccharides I"Editor, Alexander Steinbuchel ; Publisher, Wiley-VCH(印刷中). (2001)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon.: "Crystal structure of alginate lyase A1-III complexed with trisaccharide product at 2.0 Å resolution."Journal of Molecular Biology. (In press). (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon.: "Effect of His192 mutation on the activity of alginate lyase A1-III from Sphingomonas species A1."Journal of Microbiology and Biotechnology. 11(1), (In press). (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Takafumi Itoh.: "Crystal structure of N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase from porcine kidney at 2.0 Å resolution."Journal of Molecular Biology. 303(5). 733-744 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Keiko Mamma.: "A novel bacterial ATP-binding cassette (ABC) transporter system that allows uptake of macromolecules."Journal of Bacteriology. 182(14). 3998-4004 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto.: "Molecular identification of oligoalginate lyase of Sphingomonas sp.strain A1 as one of the enzymes required for complete depolymerization of alginate."Journal of Bacteriology. 182(16). 4572-4577 (2000)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon.: "Overexpression in Escherichia coli, purification, and characterization of Sphingomonas sp.A1 alginate lyases."Protein Expression and Purification. 19(1). 84-90 (2000)

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      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto.: "Biodegradation of alginate, xanthan, and gellan. In "Biopolymers" volume 7 : Polysaccharides I"Editor, Alexander Steinbuchel ; Publisher, Wiley-VCH, (In press). (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2000 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Crystal structure of alginate lyase A1-III complexed with trisaccharide product at 2.0 Å resolution"Journal of Molecular Biology. (印刷中). (2001)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Effect of His192 mutation on the activity of alginate lyase A1-III from Sphingomonas species A1"Journal of Microbiology and Biotechnology. (印刷中). (2001)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Takafumi Itoh: "Crystal structure of N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase from porcine kidney at 2.0 Å resolution"Journal of Molecular Biology. 303・5. 733-744 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Keiko Momma: "A novel bacterial ATP-binding cassette (ABC) transporter system that allows uptake of macromolecules"Journal of Bacteriology. 182・14. 3998-4004 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Molecular identification of oligoalginate lyase of Sphingomonas sp.strain A1 as one of the enzymes required for complete depolymerization of alginate"Journal of Bacteriology. 182・16. 4572-4577 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Overexpression in Escherichia coli, purification, and characterization of Sphingomonas sp.A1 alginate lyases"Protein Expression and Purification. 19・1. 84-90 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Biopolymers. Volume 7: Polysaccharides I"Editor, Alexander Steinbuchel; Publisher, Wiley-VCH(印刷中). (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Characterization of α-L-rhamnosidase of Bacillus sp.GL1 responsible for the complete depolymerization of gella"Archives of Biochemistry and Biophysics. 368巻,1号. 56-60 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Unsaturated glucuronyl hydrolase of Bacillus sp.GL1: Novel enzyme prerequisite for metabolism of unsaturated oligosaccharides produced by polysaccharide lyases"Archives of Biochemistry and Biophysics. 368巻,2号. 367-374 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Overexpression in Escherichia coli and characterization of Sphingomonas sp.A1 alginate lyase"Protein Expression and Purification. (印刷中). (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Hye-Jin Yoon: "Crystal structure of alginate lyase A1-III from Sphingomonas sp.strain A1 at 1.78A resolution"Journal of Molecular Biology. 290巻. 505-514 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Enzymatic and Genetic Bases on Assimilation, Depolymerization, and Transport of Heteropolysaccharides in Bacteria"Journal of Bioscience and Bioengineering. 87巻,2号. 123-136 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Keiko Momma: "Special cell surface structure,and novel macromolecule transport/depolymerization system of Sphingomonas sp A1"Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 23巻,4/5号. 425-435 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Sphingomonas sp.Al lyase active on both poly-β-D-mannuronate and hetero-polymeric regions in alginate." Journal of Fermentation and Bioengineering. 86巻・2号. 236-238 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Polysaccharide lyase:Molecular cloning of gellan lyase gene and formation of the lyase from a huge precursor protein in Bacillus sp.GL1." Archives of Biochemistry and Biophysics. 354巻・1号. 31-39 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Molecular cloning of two genes for β-D-glucosidases in Bacillus sp.GL1 and identification of one as a gellan-degranding enzyme." Archives of Biochemistry and Biophysics. 360巻. 1-9 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Enzymatic and Genetic Bases on Assimilation, Depolymerization and Transport of Heteropolysaccharides in Bacteria." Journal of Bioscience and Bioengineering. 87巻・2号. 123-136 (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Wataru Hashimoto: "Microbial system for polysaccharide depolymerization:Enzymatic route for gellan depolymerization by Bacillus sp.GL1." Archives of Biochemistry and Biophysics. 339巻. 17-23 (1997)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Yoon Hye Jin: "Crystal structure of alginate lyase Al-III from Sphingomonas species Al at 1.78 A resolution." Journal of Molecular Biology. 発表予定(印刷中). (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書

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公開日: 1998-04-01   更新日: 2016-04-21  

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