| 研究課題/領域番号 |
10660093
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
土居 克実 九州大学, 農学部, 講師 (40253520)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
1999年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1998年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | Streptomyces azureus / Streptomyces lividans TK24 / プラスミド / gene dosage / 胞子形成阻害 / His-tag / EGFP融合タンパク質 / 位相差蛍光顕微鏡 / Streptomyces / spolllE様遺伝子 / 遺伝子ライブラリー / spi遺伝子 / His・tag / GFP融合タンパク質 / 膜局在性 |
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| 研究概要 |
放線菌のDNA転移に関与する遺伝子発現制御機構の時間的・空間的解析を行うため、Streptomyces azureusのプラスミドpSA1.1上の宿主胞子形成阻害とプラスミド転移に機能するspiの発現について研究を進めた。まず、spiプロモーターを含み、C末端側に6個のHisをコードするようにしたspi-his-tag遺伝子を増幅し、pUC118にクローニングした。組換え大腸菌中で発現を試みたところ、可溶性画分にはバンドが認められず、不溶性画分に約50kDaのバンドが認められた。従って、目的のSpi-His-tagタンパク質は細胞膜に局在すると推定した。次に、作製したspi-his-tag遺伝子を放線菌の高コピーベクターpIJ702と低コピーベクターpRES18にそれぞれ挿入した。これらをStreptomyces lividans TK24株、およびpSA1.1を保持したTK24株に形質転換し、それぞれの生育を検したところ、液体培養ではTK24(pRES18(spi-his-tag)+pSA1.1)の生育が最も良好で、TK24(pIJ702(spi-his-tag))の生育が最も遅かった。固体倍地上ではTK24(pRES18(spi-his-tag)+pSA1.1)とTK24(pRES18(spi-his-tag))に差異が認められなかったが、TK24(pIJ702(spi-his-tag))やTK24(pIJ702(spi-his-tag)+pSA1.1)の増殖は上記の2菌株に較べ遅いことが示された。これは、spiが高コピー数発現したために生じた宿主に対する胞子形成阻害と考えられた。さらに、spiとEGFPの融合遺伝子をを作製し、pRES18にクローニング後、TK24株に形質転換した。固体培養菌体の蛍光顕微鏡観察を行ったところ、蛍光が培養2日目の菌体のほぼ全域から検出された。よって、spiは固体培養では、早期に菌糸全域で発現していることが分かった。
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