| 研究概要 |
高等植物におけるアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)アイソザイムの発現調節機構と生理的意義、およびアスコルビン酸(AsA)生合成機構を明らかにすることを目的として以下の3つの項目について検討を行った。
1)チラコイド型APX(tAPX)およびストロマ型(sAPX)は同一の遺伝子から3'末端の選択的スプライシングにより生成している。RT-PCRによる解析の結果、ApxIIから分子量の異なる4種類のmRNA(tAPX-I, sAPX-I, -II, -III)が生成していることが明らかになった。S1ヌクレアーゼアッセイの結果から、播種4週間後のホウレンソウ葉には、sAPX-I, -II, -IIIおよびtAPX-Iがそれぞれ21:5:32:42の割合で存在することが明らかになった。このことから、高等植物における葉緑体型APXアイソザイムの発現調節は選択的スプライシングに依存していることが明らかになった。
2)ホウレンソウに存在するAPXアイソザイム(sAPX, tAPX, ミクロボディ型;mAPX, 細胞質型;cAPX)の種々の環境ストレスに対する応答機構を解析した。その結果、cAPXのみが強光およびパラコートストレスにより転写レベルで発現誘導されたが、他のアイソザイムは応答性を示さなかった。cAPXの発現は強光ストレスにより転写および活性レベルで経時的に上昇していた。sAPXおよびtAPXは転写レベルおよびタンパク質レベルが変化していないのに反し、活性レベルが著しく減少していた。また、強光条件下においてH2O2量の一時的な上昇およびアスコルビン酸の酸化還元状態の変化が認められた。
3)AsA生合成系の最終段階を触媒するL-ガラクトノ-γ-ラクトン脱水素酵素(GALDH)の細胞内局在性を検討した結果、GALDH活性はミトコンドリアの膜画分においてのみ認められた。cDNA解析の結果、GALDHは1761bpのORFを含み、587アミノ酸残基からなる推定分子量66755Daのタンパク質をコードしていた。N末端領域にはミトコンドリアヘのトランジットペプチドが存在した。リコンビナントGALDHは他の植物種由来のGALDHと同様にシトクロームcを電子受容体とした。また、L-ガラクトノ-γ-ラクトンに高い特異性を示し、他の類似体ではほとんど活性を示さなかった。
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