| 研究課題/領域番号 |
10660292
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
基礎獣医学・基礎畜産学
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
前原 信敏 北里大学, 獣医畜産学部, 教授 (90072371)
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| 研究分担者 |
佐藤 久聡 北里大学, 獣医畜産学部, 講師 (40154083)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
1999年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1998年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | Staphylococcus hyicus / 表皮剥離脱毒素 / 発現 / 遺伝子 / Escherichia coli / 表皮剥脱毒素 / 遺伝子発現 / ヒスチジン融合蛋白 |
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| 研究概要 |
既に明らかにしたStaphylococcus hyicus表皮剥離毒素B(SHETB)遺伝子およびStaphylococcus aureus表皮剥離毒素C(ETC)遺伝子の塩基配列を基に上流側にBam HI、下流側にEco RI認識配列を付加したプライマーを作製し、PCR法により両遺伝子のOpen reading frameを増幅した。これらの増幅断片をBam HIおよびECO RIで消化後、同酵素で消化したpET-32aに挿入し、Escherichia coli BL21(DE3)株に形質転換した。次いで、両遺伝子を形質転換した株をIPTG存在下で培養し、これらの菌体を超音波により粉砕後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気永動(SDS-PAGE)に供したところ、両遺伝子形質転換株で推定分子量(47kDa)と一致したヒスチジン融合タンパクの発現が認められた。そこで菌体破砕物をヒスチジンとの結合能を有するニッケルキレートカラムでアフィニティー精製した。これらの精製ヒスチジン融合蛋白をSDS-PAGEで解析したところ、上記の47kDa蛋白のみが認められた。両組換え蛋白をSHETBの感受性動物である1日齢ニワトリひな、ETCの感受性動物である(1)日齢ニワトリひなと哺乳マウスに皮下摂取したところ、摂取1時間後には表皮剥離減少が認められたため、本蛋白を組換え型SHETB(r-SHETB)、組換え型ETC(r-ETC)とした。SHETBとr-shETB、ETCとr-ETCならびに各々の毒素に対するモノクローナル抗体を用いてwestern blot解析を行ったところ、SHETBとETCは27kDa、r-SHETBとr-ETCは47kDaの位置に付加配列により20kDa程分子量が大きくなっているものの、本来の毒素と同一の毒素活性ならびに抗原性を有していることが明らかとなった。S.hyicusからの精製SHETB回収量、S.aureusからの精製ETC回収量に比べr-SHETBとr-ETCの回収量は10〜75倍多いので、これらの組換え毒素蛋白は毒素の構造活性関連の解析に有用であると思われる。
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