| 研究課題/領域番号 |
10670006
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
解剖学一般(含組織学・発生学)
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
豊田 直二 千葉大学, 医学部, 講師 (00188822)
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| 研究分担者 |
小宮山 政敏 千葉大学, 医学部, 助手 (70175339)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2000年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1999年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1998年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | 遺伝子導入 / エピトープタッギング / 強制発現 / troponin / 筋蛋白質 / ニワトリ胚 / DNA導入 / GFP蛋白質 / レポータージーン / 筋 / エレクトロポーレーション / 誘導因子 / レポーターシーン / 電気穿孔法 / pGFP |
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| 研究概要 |
組織や細胞に特定の物質を強制的に発現させ、また欠失させることにより物質の機能を推測、解析することはサイエンスとして明解な成果が期待でき、また研究者を魅了する方法論である。すでにトランスジェニックマウスやノックアウトマウスは一般的になりつつあるが、もっと簡単に鶏卵や培養細胞のレベルで同様なことができれば労力もかからず、手早く行うことができる。鶏卵は殻を切り取り、発生を上から顕微鏡で観察することができるので、脊椎動物の分化を解析するのに適している。このような系で誘導因子、分化因子を発現および欠失させ、どのような発達が起こるかを観察することは学問的にも意義のあることと思われる。当研究計画の期間にこのような様々な導入法を試みたが結論として大げさな機械類を利用した結果より、薬品を用いて小規模に行ったほうが良い結果が得られた。リポフェクトアミンとDNAを混ぜ、培養細胞に滴下する方法が最も簡単で効率良く、目的の物質を強制的に発現できた。この方法で最大10%の細胞に発現させることができた。蛍光抗体法による顕微鏡観察、Western blotによる発現効率の検定など特に問題もなくデーターがとれた。この方法を用いてタッギングしたトロポニン分子を筋細胞の筋原線維に取り込ませることができた。また心筋troponin Iと骨格筋troponin Iの頭部と尾部を入れ換えたキメラを作成しそれぞれの筋に発現させたところtroponin Iは分子のC末端側に筋原線維との結合に関係の深い部分のあることが明らかとなった。期会が有ればさらに効率発現のよいアデノウイルスベクターを使ってみたい。このベクターは、ほぼ100%の細胞に一過性に目的の蛋白質を強制的に発現させることができる。また物質を欠失させるところまで研究が進まなかったが、これも将来に試みてみたいと思っている。
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