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ラットクローン上皮性Na^+チャネルのヌクレオチド結合ドメインを介する機能調節機構

研究課題

研究課題/領域番号 10670053
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 生理学一般
研究機関北海道大学

研究代表者

石川 透  北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (70249960)

研究期間 (年度) 1998 – 1999
研究課題ステータス 完了 (1999年度)
配分額 *注記
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
1999年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1998年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
キーワードENaC / ATP / Patch-clamp / Patch―clamp
研究概要

ラットクロ―ン化上皮性Na^+チャネル(rENaC)を構成するα、β、γサブユニットを安定型発現しているNIH-3T3細胞を用いて以下の研究成果を得た。ホールセルパッチクランプ法を用いることにより、この発現系におけるrENaC活性に起因するホールセル内向き電流を抽出することに成功し、この電流のアミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節、イオン選択性を電気生理学的特徴を明らかにした。さらに単一電流記録法を用いることにより、この発現系におけるrENaCを機能的に単一チャネルレべルで同定し、その単一チャネルコンダクタンス、イオン選択性、アミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節を明らかにした。
ホールセル電流測定実験で、 (1)Cs-gltamateを基本にしたピペット内液を用いると、rENaC活性に依存する内向き電流のrun-downが起きること、 (2)10mMEGTAを用いてピぺット内液の遊離Ca^<2+>濃度を低くしてもこのrun-downは影響されないが、ATPをピぺット内液に加えるとrun-downがATP濃度依存性に抑制され、そのKmt値は0.3mMであること、 (3)run-downの抑制作用はATP>ADP=GTP=UTP=AMPの順であること、 (4)EDTA (10mM)をMgを含まないピぺット内液を加えてもATPのrun-downの抑制効果に変化がないこと、 (5)ATPの代わにATP-γSやAMP-PNPを用いてもATPの時と同様にrun-downの抑制効果が見られることがわかった。さらにoutside-outパッチを用いた単一チャネル電流測定実験により、(1)上記ホールセル実験で用いたさまざまな細胞内液条件下(ヌクレオチドなし、ATP(10mM), ATP(10mM)+EDTA(10mM), ADP(2mM),ATPgS(2mM),AMP-PNP(2mM),UTP(2mM),GTP(2mM))でrENaC単一チャネルコンダクタンスが変化しないこと、 (2)ピぺット内液(この場合細胞膜の細胞内側を潅流していることになる)中にATPを含まないとNPoで定義されるチャネル活性の時間依存性のrun-downが見られ、このrun-downはATPの濃度依存性に抑制されること、 (3)ADPではrun-downが抑制されないことがわかった。従って上記ホールセル実験で見らられたrun-downはチャネル活性のrun-downとして理解され、rENaCが細胞内ATP濃度により機能調節される可能性が示唆された。これらの機能実験の他にαサブユニットのC端およおびN端に存在するグリシンに富むヌクレオチド結合ドメインに注目し、まずそれそれN端またはC端ヌクレオチド結合ドメインのグリシンをすべてアラニンに変異させたαサブユニットを作成した.さらにこの変異体サブユニットを発現するNIH3T3細胞を作成するために、まず野性型βおよびγサブユニットを安定型発現する細胞株の作成を行い、現在そのスクリーニングをおこなっている,βおよびγサブユニットをともに発現する細胞を作成後、変異体α-サブユニットを遺伝子挿入法を用いて作成し、細胞内ヌクレオチドの効果を系統的に調べる予定である.

報告書

(3件)
  • 1999 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1998 実績報告書
  • 研究成果

    (10件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (10件)

  • [文献書誌] Staub Olivier.et al.: "Regulation of ENaC by Nedd4 and Ubiquitination"Kidney International. 57(3). 809-815 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Staub Olivier.et al.: "Regulation of ENaC by Interacting proteins and by ubiquitination"Current Topics in Membranes. 47. 65-85 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ishikawa Toru et al.: "Electrophysiological characterization of the rat epithelial Na^+ channel(rENaC)expressed in Madin-Darby Canine Kidney cells : Effects of Na^+ and Ca^<2+>"Journal of General Physiology. 111. 825-846 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Staub, Olivier. Et al.: "Regulation of ENaC by Nedd4 and Ubiquitination."Kidney International. 57(3). 809-815 (2000)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Staub Olivier. Et al.: "Regulation of' ENaC by Interacting proteins and by ubiquitination."Current Topics in Membrancs. 47. 65-85 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ishikawa. Toru et al.: "Electrophysiological characterization of the rat epithelial Na' channel (rENaC) expressed inMadin-Darby Canine Kidney cells: Effects of NaィイD1-ィエD1 and CaィイD22+ィエD2."Journal of General Physiology. 111. 825-846 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1999 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] O.Staub et al.: "Regulation of ENaC by Nedd4 and Ubiquitination"Kidney International. (印刷中). (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Staub,Olivier et al.: "Regulation of ENaC by Nedd4 and Ubiquitination." Kidney International. (印刷中). (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Staub,Olivier et al.: "Regulation of ENaC by Interacting Proteins and by Ubiquitination." Current Topics in Membranes. 47. 65-85 (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Ishikawa,Toru et al.: "Electrophysiological characterization of the rat epithelial Na^+channel (rENaC) expressed in Madin-Darby Canine Kidney Cells : Effects of Na^+ and Ca^2" Journal General Physiology. 111. 825-846 (1998)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書

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公開日: 1998-04-01   更新日: 2016-04-21  

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