| 研究課題/領域番号 |
10670214
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
実験病理学
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
小山田 正人 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (30183255)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1998年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 細胞間コミュニケーション / ギャップ結合 / コネキシン / green fluorescent protein / 共焦点レーザ顕微鏡 / カルシウムイメージング / GFP / マイクロインジェクション / Hela細胞 |
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| 研究概要 |
1.ギャップ結合蛋白質(コネキシン)の生細胞における局在の可視化
コネキシン43(Cx43)遺伝子のコーディング領域のC末にオワンクラゲのgreen fluorescent protein(GFP)をつなぎ、コネキシンGFP融合蛋白質を培養細胞に発現させることにより、生細胞におけるコネキシンの局在の可視性に成功した。Cx43-GFP融合蛋白質を発現された。HeLa細胞では、融合蛋白質は細胞膜に線状あるいは点状、斑状に局在を示した。ethidium bromideの単一細胞へのmicroinjectionによって、色素は隣接する細胞に移行し、導入されたconnexin-GFP融合蛋白質が機能的ギャップ結合を形成できることが示された。同一視野での局在を時間経過とともに観察すると、細胞質内の小胞が細胞膜に融合する像が得られた。
2.コネキシンの局在と細胞内カルシウムイオンのリアルタイム同時可視化
Cx43-GFP及びCx40-GFP融合蛋白の発現ベクターを作成し、新生仔ラット初代培養心筋細胞に導入後、Fura Redを用いることで、細胞内カルシウムの変化をコネキシン-GFPと同時に可視化することに成功した。
3.Dominant-negative Cx43-GFP融合蛋白質発現ベクターによるギャップ結合コミュニケーションの阻害
Cx43遺伝子に突然変異に導入することにより、野生型Cx43機能を阻害するdominant negative変異Cx43遺伝子にGFP遺伝子を融合し、dominant-negative Cx43-GFP融合蛋白発現ベクターを作成した。もともと野生型Cx43を発現しギャップ結合細胞間コミュニケーション機能の高い肝上皮細胞株IRA20細胞に導入することによって、野生型Cx43の機能を阻害することを確認した。このdominant-negative Cx43-GFP融合蛋白発現べクターは、細胞集団の特定の細胞のみのギャップ結合機能を特異的に阻害することを可能にするもので、ギャップ結合の生細胞における機能を解析する上で非常に有効なツールとなる。
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