| 研究課題/領域番号 |
10670666
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
循環器内科学
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| 研究機関 | 高知医科大学 |
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研究代表者 |
宮原 馨 高知医科大学, 医学部, 助手 (30229877)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1999年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1998年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | NOS遺伝子 / 血管内皮 / プロモーター活性 / 転写因子 / NO合成酵素 / 一酸化窒素 / プロモーター |
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| 研究概要 |
NO合成酵素(NOS)は血管内皮細胞に特異的に発現しており、生成される一酸化窒素(NO)すなわち内皮細胞由来弛緩因子(EDRF)が血管弛緩等の作用を起こしている。 NO合成酵素遺伝子上流域にあるGATA転写因子による報告がされているが、我々の系では、この因子による活性化は認められず、むしろ、上流90bpに、Sp1結合配列以外に転写に関与する新しい領域を見いだした。この上流90bpにあるCCCTC配列を3回含むホモピリミヂン鎖領域が結合に必須であることがわかった。しかも、この結合には、3つのCCCTC配列すべてが必要で、1つでも欠けると、結合能が著しく低下することが、ゲルシフトアッセイ法によって解った。そして、転写活性は、結合能を反映し、CCCTC配列の変異によって低下することがわかった。DNase Iフットプリント法により、Sp1結合配列から-16まで、約92bpという長い領域が連続して保護されていることが判明した。 UV-クロスリンク法によって97kDaのタンパクを同定し、臍帯内皮細胞由来のcDNAの発現ライブラリーをスクリーニングすることで、クローンした結果、Sp1因子のクローンが得られた。しかし、この結合領域に結合する主なタンパク因子は、Sp1ではないことが解っているため、さらに、サウスウエスタン法を用いて、そのエレメントに結合する蛋白質因子を解析し、60および39kDaの主要なタンパクを同定した。これらのタンパクの解析を進めるためにあらたにcDNAライブラリーをスクリーニングしたが、ポジティブなクローンは得られなかった。 CCCTC配列を3回含むホモピリミヂン鎖領域にかなりの類似性のある配列が、c-myc遺伝子のプロモータ領域にある。そこに結合する転写因子として、CTCF、MAZが報告されている。これらに対する、抗体を用いて、ゲルシフトアッセイを行ったが、特異的な複合体の阻害などは検出されなかった。MAZ因子が、NO合成酵素遺伝子の転写に関与するという報告がなされているが、はっきりしない。 また、我々は、HIV(human immunodeficiency virus)のtat因子によって、NOS遺伝子のプロモーター活性は上昇することを見いだした。この活性上昇には、従来よく知られている転写因子NF-kBが関与すると思われていたが、Sp1結合配列およびこの上流90bpが関与することを明らかにした(Chen et al.1999)。
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