| 研究課題/領域番号 |
10671385
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
整形外科学
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| 研究機関 | 東京歯科大学 |
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研究代表者 |
高橋 正憲 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (10095622)
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| 研究分担者 |
兼子 智 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40214457)
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| 研究期間 (年度) |
1998 – 1999
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| 研究課題ステータス |
完了 (1999年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
1999年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1998年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | 凍結保存 / 骨膜 / ジメチルスルフォキシド / プログラムフリージング / ミトコンドリア / egg yolk |
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| 研究概要 |
骨膜凍結条件を決定した。凍結保護剤にはヒト胚の培養に用いられるIVF AH25培養液に0.2Mトレハロース、抗生物質(ホスミシン、10μg/ml)、12%ジメチルスルフォキシド(DMSO)および50%(V/V)鶏卵黄を添加したものを用いた。受精18日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を直接凍結保護材1.0ml含む凍結バックに入れ、シールした後エタノールを冷媒としたプログラムフリーザーを用い、室温/+-7℃(2.0℃/分)、-2.0℃/40℃(1.0℃/分)で凍結し、その後直ちに液体窒素に浸漬して-196℃とし、凍結保存した。融解は微温湯中で行い、培養液で洗浄した。融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撮影を行い、骨形成の有無を確認した。
凍結保護剤の添加、除去方法の検討した結果、凍結保護剤に骨膜を直接添加し、融解後は培養液で直接洗浄することにした。3.DMSO不含凍結保護剤を用いた場合は新生骨形成を認めず、凍結保存に際してDMSOが必須であることを認めた。DMSO濃度は6-18%の範囲で同程度の骨新生を認め、本研究では12%を採用した。一方、卵黄不含凍結保護剤では新生骨形成は著しく低く、骨膜の凍結に際してはDMSOとともに卵黄が重要な意義を有することを見いだした。卵黄濃度は10-88%の範囲で保護効果を認めた。さらに精製卵黄レシチンを卵黄の代わりに添加しても、卵黄の場合と同様な保護効果を認めた。長期保存(1週間、1ヶ月、3ヶ月)を行った結果、いずれも同程度の骨新生率を認め、長期保存が可能であることが示唆された。
透過型電子顕微鏡を用いて細胞像を観察した結果、組織表層の細胞は小器官の膨化等の変性像を認めたが、深層部では細胞膜、小器官の形態が保持されていた。上述した細胞酸化還元能の結果とともに、組織の一部が機能を保持したまま凍結保存できたと考えられる。
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