アラニンアミノ基転移酵素の基質特異性の解析

• 研究課題/領域番号: 10680585
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 助教授 (20112401)
• 研究分担者: 檜垣 強 熊本大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (70128304)
• 研究期間 (年度): 1998 – 2000
• 研究課題ステータス: 完了 (2000年度)
• 配分額: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円); 2000年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 1998年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: アラニン / アミノ基転移酵素 / 基質特異性 / タンパク質工学 / 変異酵素 / 補酵素 / ビタミンB6 / PCR / アラニン酸

研究概要

アミノ基転移酵素群では、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)の研究が最も進んでおり、結晶構造の解析や部位特異的突然変異体の研究により、基質特異性を規定している酵素構造と触媒反応機構との関係が明らかになりつつある。しかし、他のほ乳類アミノ基転移酵素の基質特異性と酵素構造との相関は、立体構造解析の進捗の遅さもあり解明が進んでいない。ここでは、1)ヒトアラニンアミノ基転移酵素(AlaAT)の微生物での発現系の構築、2)推定される基質結合部位を中心とした変異型酵素の作成と機能解析、3)さらにはAlaATの厳密な基質特異性を規定している構造要因を特定し、他のアミノ基転移酵素のそれと比較検討することにより、多くのアミノ基転移酵素群に共通するジカルボン酸に対する選択性と、その共通性と相反する個々のアミノ基転移酵素に固有の基質特異性を担う構造要因に関して解析することを目的とする研究を開始し、以下の成果を得た。
大腸菌および酵母における発現系を構築したが、当初の目的、酵素の結晶化および機能解析に十分量の蛋白量が得られなかったことから、ベクター系の変更ならびに発現菌培養条件等を検討し、活性を有する酵素タンパクの生産を試みた。同時に5'末端側塩基配列の変更やプロモータの変更を行ったが、期待した発現量の増大ならびに活性酵素を得ることができなかった。再度、ベクターに組み込まれたDNA配列の正確性を検討した。その結果、数カ所の配列の訂正を行い、発現ベクターへの組み込みを行った。
AlaATアミノ酸配列を他のアミノ基転移酵素の配列と比較し、基質認識部位を想定することができた。