| 研究概要 |
(1)パルスラジオリシス法によるMDAと還元型チトクロムb561との電子伝達反応の解析を行った。ミリ秒領域においてMDAは還元型ヘムを酸化し、秒領域ではAsAによる酸化型ヘムの再還元が見られた。MDAによる酸化はpH5.5で最大の値を示し、pHが上昇すると、その速度は減少した。一方、AsAによる還元過程は中性付近で速度が最大となった。このことは、2つの電子伝達反応が全く違う部位において行われていることを示している。過剰量のMDA存在下でもチトクロムb561の半分のヘムしか酸化されず、全ヘムの半分のみがMDAとの反応性を持つことがわかった。
(2)酸化型チトクロムb561をDEPC(diethyl pyrocarbonte)で処理すると、AsAからの電子伝達が阻害され。ヘムの還元速度が顕著に低下し、約半分のヘムしか還元されないことがわかった。パルスラジオリシス法によりMDAとの反応を調べると、還元型ヘムの酸化過程は未処理の場合と同程度であったが、続くAsAによるヘムの最還元過程は全く観察されなかった。DEPCによる修飾部位をtrypsin,V8 protease消化断片のMALDI-TOF-MSスペクトルにより解析した結果、His88,His161,Lys85の3つの残基が修飾されていることがわかった。細胞質側ヘムの配位子His88,His161の修飾が起こり、AsAからの電子受容ができなくなったと考えられる。以上の結果は、チトクロムb561中の2つのヘムは、AsAとMDAとの電子伝達反応において別個の役割を持ち、MDAは小胞内側に位置するヘムを酸化し、その後、細胞質側に位置するヘムからの分子内電子伝達反応が起こると、酸化された細胞質側ヘムが再びAsAにより還元されると思われる。
(3)下等な中枢神経系を持つプラナリア(扁形動物門)におけるチトクロムb561の全長のcDNAクローンを得ることに成功した。アミノ酸配列解析により、高等動物で完全に保存されて、機能的に重要な役割を持っていると思われる2つの保存性領域が、プラナリアb561においても完全に保存されていることが明らかとなった。高等動物において完全保存されていた6つのHis残基の内の1つが、Asn残基ち置換していることがわかった。この結果、細胞質側のヘムの配位子が特定できた。
(4)植物(Arabidopsis thaliana)にもチトクロムb561に類似したタンパク質が発現している。このb561類似タンパク質の全一次構造を明らかにするため、A.thaliana cDNAライブラリーからcDNAクローニングを行った。2種類のクローンが得られ、その全長配列を調べた。動物で見られた2つの保存性領域の内、細胞質側に位置しAsAとの相互作用に関与すると思われている領域の保存性は良くなかった。小胞内側に位置しMDAとの相互作用に関与すると思われる領域は良く保存されていた。6つの保存性His残基の内、プラナリアb561でAsn残基に置換していたHis残基が2つのクローンのうちの1つではGln残基に置換されていた。この結果は、プラナリアb561cDNAの解析結果を裏付けるとともに、植物のチトクロムb561は生理的役割が動物チトクロムb561とは異なる方向に分子進化したものであることを示している。
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