• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 前のページに戻る

小胞体プロセシング酵素cDNAの機能的クローニング

研究課題

研究課題/領域番号 10740374
研究種目

奨励研究(A)

配分区分補助金
研究分野 植物生理
研究機関東京都立大学

研究代表者

岡本 龍史  東京都立大学, 理学研究科, 助手 (50285095)

研究期間 (年度) 1998 – 1999
研究課題ステータス 完了 (1999年度)
配分額 *注記
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1999年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1998年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
キーワードプロテアーゼ / 小胞体 / 液胞 / プロセシング / KDEL配列 / パパインファミリー / 発芽種子 / cDNA / 細胞内輸送 / 種子発芽
研究概要

システイン・プロテアーゼ(SH-EP)のKDEL配列を含むC末端プロペプチドを切断すると推定される小胞体プロセシング酵素(VmCP)の活性測定法を確立したのち、ケツルアズキ発芽子葉より調整したミクロソーム膜画分から陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過によりERPEを精製し、その性質を調べた。VmCPの分子質量は32kDaであり、その活性はE-64により阻害された。VmCP cDNAを発芽子葉のcDNAライブラリーから単離しその一次構造を決定したところ、VmCPはパパインファミリーのプロテアーゼであることが明らかになった。次に、VmCPを大腸菌内で発現させ、そのリコンビナントタンパク質を抗原として、抗VmCP抗体を調整した。ショ糖密度勾配法による細胞内分画の結果、VmCPは小胞体のマーカータンパク質であるBiPと同じ画分に活性をもつ成熟型酵素として存在することが示され、さらに、免疫組織化学的染色法によりVmCPの細胞内局在性を観察したところ、VmCPは小胞体と液胞の両細胞内小器官に局在していた。また、cDNAより推定されるVmCPのアミノ酸配列には膜貫通領域は見られなかったが、子葉細胞の細胞内分画によりこのプロテアーゼが膜結合性の酵素であることが示された。さらに昆虫培養細胞でVmCPを発現させたところ、昆虫細胞内においてもその酵素は膜に結合していたことから、VmCPの膜への結合はケツルアズキ子葉細胞中のみでおこる現象ではなく、VmCPタンパク質自体がもつ性質によるものであることが示唆された。これらのことからVmCPは小胞体および液胞膜上に局在し、両細胞内小器官で活性をもつプロテアーゼであることが推定された。

報告書

(2件)
  • 1999 実績報告書
  • 1998 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (8件)

  • [文献書誌] Okamoto Takashi: "Posttranlational removal of the carboxyterminal KDEL of the cysteine protease SH-EP occurs prior to maturation of the enzyme."Journal of Biological Chemistry. 274. 11390-11398 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Okamoto Takashi: "Asparaginyl endopeptidase (VmPE-1) and autocatalytic processing synergistically activate th vacuolar cysteine proteinase (SH-EP)."European Journal of Biochemistry. 264. 223-232 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Okamoto Takashi: "Molecular cloning and characterization of Vigna mungo processing enzyme 1 (VmPE-1), an asparaginyl endopeptidase possibly involved in post-translational processing of a vacuolar cysteine endopeptidase (SH-EP)."Plant Molecular Biology. 39. 63-73 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Toyooka Kiminori: "Mass transport of a KDEL-tailed cysteine proteinase (SH-EP) to protein storage vacuole by ER-derived vesicle is involved in protein mobilization in germinating seeds."Journal of Cell Biology. (in press). (2000)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Zhong Peing: "Synthesis and degradation of a 28-kDa pod storage protein in French bean (Phaseolus vulgaris) plants."Planta. 210. 72-79 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Hosokawa Tomoki: "Characterization of serine endopeptidases in cotyledons of germinated Vigna mungo seeds."Journal of Plant Research. 112. 217-221 (1999)

    • 関連する報告書
      1999 実績報告書
  • [文献書誌] Okamoto,T.et al.: "Posttranlational removal of the carboxyterminal KDEL of the cysteine Protease SH-EP occurs in prior to maturation of the enzyme." Journal of Biological Chemistry. 印刷中. (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書
  • [文献書誌] Okamoto,T.and T.Minamikawa: "Molecular cloning and characterization of Vigna mungo processing enzyme 1(VmPE-1), an asparaginyl endopeptidase possibly involved in post-translationalprocessing of a vacuolar cysteine endopeptidase (SH-EP)." Plant Molecular Biology. 印刷中. (1999)

    • 関連する報告書
      1998 実績報告書

URL: 

公開日: 1998-04-01   更新日: 2016-04-21  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi